Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue

硬組織線粒體分離試劑盒

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基本描述

硬組織線粒體分離試劑盒（Mitochondria Isolation Kit for Hard Tissue）是一款快速便捷的分離動(dòng)物硬組織（如：骨骼?。┚€粒體的試劑盒。本試劑盒在分離線粒體的同時(shí)，還能獲得不含線粒體的細(xì)胞漿蛋白，可用于分析細(xì)胞se素c等線粒體蛋白向胞漿的釋放。經(jīng)本試劑盒獲得的大部分線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，且維持線粒體生理功能，因此，分離所得的線粒體可用于線粒體膜電位等生理功能相關(guān)研究。另外，分離得到的線粒體也可被線粒體裂解液或其它適當(dāng)裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

本試劑盒適用于從動(dòng)物硬組織（比如：心肌、骨骼?。┗蚱渌y以分離線粒體的組織中提取線粒體。

產(chǎn)品組分

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃保存，1年穩(wěn)定。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前務(wù)必閱讀試劑盒操作流程，根據(jù)最終實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇試劑盒內(nèi)所要用到的試劑。

2） 若不是用于制備線粒體蛋白樣品，不必往線粒體裂解液和清洗液中加PMSF。

3） 分離線粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷，全部操作時(shí)間盡量控制在1h之內(nèi)。

4） 通常，在分離線粒體時(shí)前后兩次離心速度選取1000g和12,000g，如果希望純度更高，但對(duì)線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用2000g和6000g。

5） 試劑開封后請(qǐng)盡快使用，以免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果。

6） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

自備材料

1）（可選）BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒或Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒

2）尼龍網(wǎng)或細(xì)胞篩

3）低速離心機(jī)

4）勻漿器

使用方法

1. 試劑準(zhǔn)備：從冰箱取出所需試劑置于室溫融解，之后立即置于冰上待用。需要注意，如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱酥苽渚€粒體蛋白樣品，需在線粒體裂解緩沖液和清洗液內(nèi)添加PMSF (100×)，使其終濃度為PMSF (1×)。PMSF一定要在試劑加入到樣品前1-2min內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中失效。

2. 清洗：動(dòng)物禁食24h后處死，取新鮮橫紋肌等組織（不宜采用凍存組織），迅速稱重50~100mg，用預(yù)冷的清洗液清洗2次，棄清洗液，于冰上剪成30mm2大小的組織碎片。

3. 裂解：加入10倍體積預(yù)冷的線粒體裂解液，置于冰浴5-10min。

4. 勻漿I：轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的Dounce勻漿器中，勻漿10-20次?；虿捎秒妱?dòng)勻漿器，700rpm，8-10次。不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化?！咀⒁狻浚喝绻M織重量為100mg，可以粗略認(rèn)為組織的體積接近100μl，此時(shí)需加入1000μl線粒體裂解液。

5. 勻漿II：4℃攪拌孵育5-10min。用等體積的線粒體儲(chǔ)存液稀釋至勻漿液，再次重復(fù)步驟4。

6. 離心：用尼龍網(wǎng)或細(xì)胞篩網(wǎng)過濾勻漿液，4℃ 1000g離心15min，重復(fù)1次，以去除細(xì)胞核、未破碎細(xì)胞和大的膜碎片?！咀⒁狻浚喝缧璜@得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為2000g離心10min，缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會(huì)下降。

7. 上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 12000g離心10min?！咀⒁狻浚喝缧璜@得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為6000g離心10min，缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會(huì)下降。

8. 棄上清，沉淀即為線粒體?！咀⒁狻浚喝绻Ｍ@得去除線粒體后的細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)在本步驟中收集上清，且在收集上清的過程中不要觸及沉淀，隨后把收集的上清4℃ 12000g 離心10min，此時(shí)的上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。

9. 保存：棄上清，用適當(dāng)?shù)木彌_液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能分析，線粒體沉淀需重懸于線粒體保存液中；如果用于細(xì)胞漿蛋白的分析，獲得的細(xì)胞漿蛋白應(yīng)保存于蛋白保存液（1×），即按照：細(xì)胞漿蛋白：蛋白保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于雙向電泳，應(yīng)使用其它適宜的保存液。

【注意】：使用本試劑盒中的線粒體儲(chǔ)存液稀釋或儲(chǔ)存的線粒體樣品應(yīng)及時(shí)使用，以免線粒體膜電位受影響。如果不能及時(shí)使用，建議在-80℃保存。凍存后的線粒體樣品不推薦用于膜電位的檢測(cè)，但可以用線粒體蛋白或核酸的相關(guān)檢測(cè)。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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