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上海滬宇生物科技有限公司

免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

時(shí)間:2011-9-19閱讀:937
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一、免疫組化(Immunohistochemistry,IHC/ Immunocytochemistry, ICC)原理

免疫組化是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理--抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(Immunocytochemistry)。

*,抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性,即先將組織或細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來,以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,制備特異性抗體,再用這種抗體(*抗體)作為抗原去免疫動(dòng)物制備第二抗體,并用某種酶(常用辣根過氧化物酶)或*等處理后再與前述抗原成分結(jié)合,將抗原放大,由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的,因此,還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒)。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng),顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分,在顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物,從而能夠在細(xì)胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì),如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。

免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標(biāo)記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

用于病理診斷的主要有免疫熒光法和免疫酶法。免疫熒光法是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的方法之一,包括熒光抗體和熒光抗原技術(shù),具有抗原抗體反應(yīng)的特異性,染色技術(shù)的快速性,在細(xì)胞或組織上定位的準(zhǔn)確性,以及熒光效應(yīng)的靈敏性等優(yōu)勢(shì)。但是,由于免疫熒光法必須具有熒光顯微鏡,熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消退,結(jié)果不易長(zhǎng)期保存等缺點(diǎn),在普及應(yīng)用上受到一定限制,而逐漸被免疫酶法所取代。

二、IHC/ICC實(shí)驗(yàn)方法

1、儀器設(shè)備

(1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐;

(2)水浴鍋。

2、試劑

(1)PBS緩沖液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。

(2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g。

(3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。

(4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。

(5)酶消化液: a、0.1%*液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%*液:用0.1N的HCl配制。

(6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

(7)封裱劑:

a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0~9.5)等量混合;

b、油和TBS(或PBS)配制。

(8)TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標(biāo)本;pH7.0~7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。

3、操作流程

(1)脫蠟和水化

脫蠟前,應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

1)組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后再浸泡10分鐘;

2)無水乙醇中浸泡5分鐘;

3)95%乙醇中浸泡5分鐘;

4)70%乙醇中浸泡5分鐘;

(2)抗原修復(fù)

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

1)抗原熱修復(fù)

在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M*緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子,但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后,去除熱源,置入涼水中,當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。

2)煮沸熱修復(fù)

電爐或者水浴鍋加熱0.01M*緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10~15分鐘。

3)微波熱修復(fù)

在微波爐里加熱0.01M*緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5~10分鐘,反復(fù)1-2次。適用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

4)酶消化方法

常用0.1%*和0.4%*液。*使用前預(yù)熱至37℃,切片也預(yù)熱至37℃,消化時(shí)間約為5~30分鐘;*消化37℃時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。

(3)免疫組織化學(xué)染色

常見的染色方法有兩種:SP法,SABC法。以下分別列出兩種方法的實(shí)驗(yàn)步驟。

SP法

1)脫蠟、水化;

2) PBS洗2~3次各5分鐘;

3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室溫靜置10分鐘

4)PBS洗2~3次各5分鐘;

5)抗原修復(fù);

6)PBS洗2~3次各5分鐘;

7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

8)滴加Ⅰ抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)。

9)4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。

10)PBS洗3次各5分鐘;

11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置,或37℃1小時(shí);

12)抗中可加入0.05%的tween-20.

13)BS洗3次各5分鐘;

14)DAB顯色5~10分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度;

15)PBS或自來水沖洗10分鐘;

16)蘇木精復(fù)染2分鐘,鹽酸酒精分化;

17)自來水沖洗10~15分鐘;

18)脫水、透明、封片、鏡檢。

SABC法

1)脫蠟、水化。

2)PBS洗兩次各5分鐘。

3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,蒸餾水洗3次。

4) 抗原修復(fù)。

5) PBS洗5分鐘。

6) 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

7) 滴加Ⅰ抗,室溫1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)(4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘)。

8) PBS洗三次每次2分鐘。

9) 滴加*化二抗,20℃~37℃20分鐘。

10)PBC洗3次每次2分鐘。

11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘。

12)PBS洗4次每次5分鐘。

13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。

14)蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。

15)脫水、透明、封片、鏡檢。

原文地址:/biotech/Immunity/2009/k8204950112.html

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