培養(yǎng)基細(xì)胞的裂解提取和濃縮方法

培養(yǎng)基的裂解提取方法：

    1、分別取-70℃保存的各組動(dòng)物的樣品（半個(gè)腦、0.5g肌肉），放入小離心管中，在冰浴上以PBS充分洗滌2次，除去殘留血液。

　　2、用無(wú)菌*和鑷子將大鼠肌肉剪碎（腦樣品不用剪碎），放入另一小離心管中，于0℃以PBS充分洗滌，4℃，3000 rpm離心5分鐘。

　　3、吸出上清夜，盡量將管壁上的液滴吸凈，將培養(yǎng)基組織碎片轉(zhuǎn)移至組織勻漿管內(nèi)。

　　4、取2ml的裂解緩沖液（預(yù)冷至0℃），加入20μlAprotonin,20μl Trypsin，20μl NaoN4,20μl的PMSFb,20μl的leupeptins和2μl的DTT，混勻后加入勻漿管內(nèi)，在組織勻漿器上冰水浴勻漿，注意轉(zhuǎn)速不?0000 rpm。4℃放置2h，10000 rpm 4℃離心10分鐘(可延長(zhǎng))，吸取上清液（蛋白液）-20℃保存。

細(xì)胞培養(yǎng)基濃縮方法：

    （一）透析袋濃縮法

　　利用透析袋濃縮培養(yǎng)基溶液是應(yīng)用zui廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無(wú)透析袋可用玻璃紙代替），結(jié)扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30％－40％濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過(guò)后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。

　?。ǘ├鋬龈稍餄饪s法

　　這是濃縮培養(yǎng)基的一種較好的辦法，它既使培養(yǎng)基不易變性，又保持培養(yǎng)基中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內(nèi)（干燥器內(nèi)裝有干燥劑，如NaOH、CaCl2和硅膠等）。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時(shí)后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的培養(yǎng)基保存方便，應(yīng)用時(shí)可配成任意濃度使用。也可采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。

　　（三）吹干濃縮法

　　將蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，放在電風(fēng)扇下吹。此法簡(jiǎn)單，但速度慢，且溫度不能過(guò)高，不要超過(guò)15℃。

　?。ㄋ模┏瑸V膜濃縮法

　　此法是利用微孔纖維素膜通過(guò)高壓將水分濾出，而培養(yǎng)基存留于膜上達(dá)到濃縮目的。有兩種方法進(jìn)行濃縮：一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過(guò)濾器內(nèi)，在不斷攪拌之下過(guò)濾；另一種是將蛋白液裝入透析袋內(nèi)置于真空干燥器的通風(fēng)口上，負(fù)壓抽氣，而使袋內(nèi)液體滲出。

　?。ㄎ澹┠z濃縮法

　　選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過(guò)離心除去。

　?。饪s膠濃縮法

　　濃縮膠是一種高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物，具有很強(qiáng)的吸水性能。每克干膠可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物質(zhì)，如水、葡萄糖、蔗糖、無(wú)機(jī)鹽等，適宜濃縮10 000分子量以上的生物大分子物質(zhì)。濃縮后，培養(yǎng)基的回收率可達(dá)80％～90％。比濃縮膠應(yīng)用方便，直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意，濃縮溶液的pH值應(yīng)大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn)，否則在濃縮膠表面產(chǎn)生陽(yáng)離子交換，影響濃縮物質(zhì)的回收率。