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實(shí)驗(yàn)室常用微生物菌種的分離和純化方法
混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。
1、用固體培養(yǎng)基分離和純化
單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體，稱為菌落。當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)**、酵母菌、以及許多**和單細(xì)胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板的簡稱，它是指固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個(gè)孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。*常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的*常用手段。
1.1 稀釋倒平板法
首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左 右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)**細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。
1.2 涂布平板法
因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落
2、用液體培養(yǎng)基分離和純化
大多數(shù)**和**，用平板法分離通常是滿意的，因?yàn)樗鼈兊拇蠖鄶?shù)種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如一些細(xì)胞大的**、許多原生動(dòng)物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。
稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機(jī)率就會(huì)急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長。
3、單細(xì)胞（孢子）分離
只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量優(yōu)勢(shì)的種類是稀釋法的一個(gè)重要缺點(diǎn)。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細(xì)胞（或單孢子）分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的**則較難。
較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的**培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項(xiàng)操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對(duì)于個(gè)體相對(duì)較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒有顯微操作儀時(shí)，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞分離，例如將經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個(gè)細(xì)胞的液體來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。