呋喃代謝物檢測試劑盒介紹（四合一）

（四合一）

1 原理及用途

本套試劑盒有四種產(chǎn)品，采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、牛奶等樣本中的呋喃類代謝物（AOZ、AMOZ、SEM、AHD），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的呋喃代謝物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃代謝物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含呋喃代謝物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中呋喃代謝物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

四種產(chǎn)品

加樣模式統(tǒng)一：50ul樣本/孔+50ul酶/孔+50ul抗體/孔。

反應(yīng)模式統(tǒng)一：25℃，45min～15min；（具體見“6 酶聯(lián)免疫試驗步驟”）

前處理方法統(tǒng)一：即處理的一個樣本可分別用于檢測四種代謝物。做添加回收時也可以將四種高標(biāo)準(zhǔn)加入同一個樣本中，一次性處理后分別用于檢測四種代謝物。（具體見“5 樣本前處理”）

2.1 試劑盒靈敏度及檢測下限

*代謝物檢測試劑盒：0.02ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.04ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.04ppb

魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.1ppb

呋喃它酮代謝物檢測試劑盒：0.05ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb

魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb

*代謝物檢測試劑盒：0.05ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb

    魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb

*代謝物檢測試劑盒：0.05ppb（ng/ml）

組織、肝臟…………………………0.1ppb

蜂蜜、牛奶、腸衣…………………0.1ppb

魚/蝦等水產(chǎn)品組織因有一定干擾，定量下限為0.15ppb

3 試劑盒組成

四種產(chǎn)品的“衍生化試劑、底物液A、底物液B、終止液、20X濃縮洗滌液、2X復(fù)溶液”成分統(tǒng)一，可以通用。

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、鈉、濃HCl、K₂HPO₄·3H₂O、亞硝基鐵（K₂Fe（CN）₅（NO）_?2H₂O）、ZnSO₄·7H₂O

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

    實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亞硝基鐵溶液（牛奶、奶粉樣本）

11.9g亞硝基鐵加去離子水至100ml溶解。

配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶、奶粉樣本）

    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解。

配液3：0.1M K₂HPO₄ 溶液

    稱11.4g K₂HPO_4?3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml。

配液4：1M HCL

    8.6mL濃HCL加去離子水定容至100mL。

配液5：1M NaOH溶液

    稱取4g NaOH，加去離子水定容至100ml。

配液6：復(fù)溶液

    2×復(fù)溶液在使用前請按1:1稀釋。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 牛奶樣本處理方法

1）取5ml樣本于離心管中，加250ul 亞硝基鐵溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上清1.1ml，加4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；

3）在37℃過夜孵育（約16小時）或50℃（超過50℃時會影響分層效果）水浴孵育3小時；

4）分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯，振蕩5分鐘；

5）室溫下4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；

6）取出2.5ml的上層液到另一個離心管中，50-60℃氮氣或空氣吹干；

7）用1ml正已烷溶解殘留物，加入1ml復(fù)溶工作液充分振蕩混合30秒；室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘；

8）去除上層正已烷，取50μl下層液用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)為2

5.3.2 蜂蜜、組織、腸衣、肝臟樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中，加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；

2）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”

5.3.3 熟食樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于50ml離心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水，振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，去除全部液體；

2）加入5ml乙氰和5ml正己烷，振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，去除全部液體；

3）加0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘；

    注：熟食的添加回收試驗請在此步加入高標(biāo)準(zhǔn)。

4）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前需：將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干。

6.6 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)終止反應(yīng)后在10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0ppb）的吸光度值，再乘以*，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算