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上海酶聯(lián)生物研究所


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快速獲得裝配細菌基因組

閱讀:246發(fā)布時間:2012-11-2

              的基因組參照序列對微生物研究者來說具有很高的價值。因此,研究人員進行了經(jīng)年累月的繁復實驗和復雜的計算,迄今已完成了約1800種細菌的基因組裝配。日前,美國哈佛-麻省理工博德研究所的研究人員應用新方法,結合了shotgun鳥槍法全基因組測序、單分子測序和自動化計算軟件,對16個細菌樣本進行了高質量的基因組裝配,得到了品質的完成基因組。這一方法極大的減少了完成基因組裝配所花費的時間和經(jīng)費。該文章發(fā)表在Genome Research雜志上。盡可能的了解基因組信息對于微生物學研究有著基礎性的意義。使用大規(guī)模平行測序的短讀序數(shù)據(jù)進行de novo從頭裝配,這在過去曾被認為是不可能完成的任務,而現(xiàn)在終于可以借助新興技術得以實現(xiàn)。

            自動化標準測序方法所生成的基因組裝配具有優(yōu)良的品質,在某些情況下輔以少量的人工實驗,就能夠得到近乎完成的基因組。然而不論是在Sanger測序的年代還是在目前的短讀序時代,大多數(shù)基因組裝配都存在諸多錯誤和缺口。重要的是,基因組裝配zui困難(快速進化)的區(qū)域常常缺失或者產(chǎn)生錯誤。幸運的是,細菌的基因組很?。ㄒ话?-6Mb),因此在許多情況下都能夠通過額外的工作進行校正。目前,通過測序結合人工實驗和計算程序,有1800種細菌的基因組裝配已經(jīng)完成。不過此前的方法即繁復耗時又很昂貴,對快速經(jīng)濟的新基因組裝配方法的需求依然很大。為此,博德研究所開發(fā)了應用特殊算法的ALLPATHS-LG軟件,對shotgun全基因組測序數(shù)據(jù)進行裝配。該方法結合了Illumina和Pacific Biosciences測序儀各自的技術優(yōu)勢,將其生成的三種數(shù)據(jù)類型進行了混合。這些數(shù)據(jù)具有互補性,在理論上具有裝配整個基因組的能力。并且這一方法和數(shù)據(jù)處理基本都是自動化的,zui大程度的減少了時間和經(jīng)費的消耗。該方法采用的數(shù)據(jù)是Illumina生成的短讀序片段、Pacific Biosciences生成的長讀序和Illumina生成的jumping pairs數(shù)據(jù)。

               這些數(shù)據(jù)可以互相取長補短,Illumina技術在測序時由于樣品制備環(huán)節(jié)的擴增偏好會導致某些區(qū)域的覆蓋度不足或缺失,而Pacific Biosciences的單分子測序技術不需要進行擴增,可以很好的覆蓋上述區(qū)域。同時堿基讀取度高的Illumina數(shù)據(jù)也彌補了Pacific Biosciences數(shù)據(jù)的不足。研究中用于生成jumping pairs的片段大小范圍很廣,能夠覆蓋相當長的距離(5 kb以上),這樣做犧牲了一定的度。不過,Pacific Biosciences單分子測序的讀取對于中等距離很有效,彌補了這一缺陷。研究人員充分利用了三種數(shù)據(jù)的優(yōu)勢,結合度、偏好性和分辨率開發(fā)了新的裝配算法。他們首先將短讀序進行校正,應用度高的短讀序進行裝配,隨后再用長讀序和jumping pairs*其中的缺口。這一過程的算法被整合入ALLPATHS-LG軟件,輸入長讀序數(shù)據(jù)后該模塊會自動啟動。這種方法產(chǎn)生的裝配能夠兼容位點模糊性local ambiguities,允許裝配的位點中存在兩種或兩種以上的可能。這種模糊性可能是測序的系統(tǒng)性誤差產(chǎn)生的,也有可能是由裝配難以區(qū)分的重復拷貝引起的,或者是因為DNA樣本中確實存在混合性位點。原核生物在培養(yǎng)過程中的突變,以及真核細胞基因組中的等位基因多態(tài)性都可能造成這一現(xiàn)象。研究人員應用這一新方法,對16種細菌樣本進行了基因組裝配,其中有三種細菌的基因組是已完成的,可作為研究的參照序列。作為參考序列的三種細菌分別是大腸桿菌E. coli、肺炎鏈球菌S. pneumoniae和類球紅細菌R. sphaeroides。這些菌種基因組的GC含量范圍很廣,從27%到69%,可以反映不同GC含量下裝配策略的有效性。研究人員發(fā)現(xiàn)裝配的結果與參照序列存在差異,要正確評價裝配的質量就必須解讀這些差異。在早前發(fā)表的文章中,研究人員曾對E. coli參照序列進行了6處校正,對R.sphaeroides參照序列進行了374處校正。在本研究中,研究人員通過PCR、Sanger測序等方法進行驗證,進一步校正了參照序列,其中E. coli校正1處,R. sphaeroides校正32處。

              研究人員還獲取了生成S. pneumoniae參照序列的原始讀序數(shù)據(jù),使他們得以對參照序列的原始測序數(shù)據(jù)和新讀序數(shù)據(jù)進行綜合性的差異分析,當然這種差異也可能是由兩個樣品真實序列的不同所引起的。因為無法得到生成參考序列的原始DNA樣本,研究人員還不能*解釋這種差異,不過他們評估了參考序列的錯誤率。S. pneumoniae參考序列和新數(shù)據(jù)中存在63處差異,研究人員經(jīng)過驗證發(fā)現(xiàn),其中60處都是新方法的檢出正確。其余的三處,新舊兩種結果都可以說是正確的,這可能是樣品自身帶來的差異。利用新方法, E. coli參考基因組的裝配生成了一個環(huán)形重疊群contig,基本確定了所有堿基(除一個堿基以外)。R. sphaeroides基因組裝配成兩個染色體,五個質粒,形成11個重疊群。而S. pneumoniae的基因組裝配也形成了一個環(huán)形重疊群,其中存在6個模糊微點,沒有錯誤。這樣的裝配結果非常,首先三種參照樣本的基因組裝配結果都沒有缺口,其次形成的重疊群都是基本完整的染色體(或質粒),此外裝配結果的總體度比參考序列高。


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