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上海酶聯(lián)生物研究所

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DNA甲基化鑒定總有一種方法適合你

閱讀：1078發(fā)布時(shí)間：2012-9-3

一談到真核遺傳，*基因組僅僅是個(gè)起點(diǎn)，此外還有表觀基因組，這種可遺傳的DNA和組蛋白化學(xué)修飾控制著基因組的表達(dá)。

5-mC和5-hmc

DNA甲基化就是這類化學(xué)修飾中的一員，甲基化一般發(fā)生在哺乳動(dòng)物基因組CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基（5-甲基胞嘧啶/5-mC），主要集中于CpG島和基因調(diào)控元件，與基因沉默有關(guān)。

其實(shí)人們?cè)缭趲资昵熬桶l(fā)現(xiàn)了DNA甲基化現(xiàn)象，5-甲基胞嘧啶還被稱為DNA的“第五種堿基”，表觀遺傳學(xué)研究者們開發(fā)了大量的分子工具來追蹤和分析它。然而在2009年，兩組研究團(tuán)隊(duì)（洛克菲勒大學(xué)Nathaniel Heintz團(tuán)隊(duì)和哈佛醫(yī)學(xué)院Anjana Rao團(tuán)隊(duì)）同時(shí)在Nature雜志上發(fā)表了重要文章，他們發(fā)現(xiàn)了另一種甲基化修飾形式——5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），這無異于在生物學(xué)界投下一枚重磅。

“自2009年以來zui大的變化可能就是，現(xiàn)在大家的研究主要集中在這些DNA甲基化變體上，”Active Motif公司產(chǎn)品Kyle Hondorp說，Active Motif公司是一家以“促進(jìn)表觀遺傳學(xué)研究”為宗旨的美國(guó)公司。

在上述兩篇文章中，研究人員分別在小鼠Purkinje神經(jīng)元和胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了5-hmC，5-hmC與5-mC在細(xì)胞和基因組中的分布不同，5-hmC主要集中在基因片段中。TET蛋白家族的酶對(duì)5-mC進(jìn)行修飾形成了5-hmC。然而，許多傳統(tǒng)DNA甲基化研究方法都無法分辨這兩種類型的修飾，默克密理博的表觀遺傳學(xué)產(chǎn)品Michael Sturges說，這意味著人們需要重新審視過去幾十年的一些甲基化分析。

“這說明在過去15至20年間，人們收集到的數(shù)據(jù)在一定程度上包括了羥甲基胞嘧啶事件，”Sturges的同事，默克密理博的表觀遺傳學(xué)研發(fā)John Rosenfeld說。

5-fC和5-caC

不過，遺傳學(xué)字母表中可不止這六個(gè)成員，除了A、C、G、T、5-mC和5-hmC，至少還存在兩種甲基化修飾類型。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)對(duì)真核生物的胞嘧啶殘基進(jìn)行甲基化。Tet1能夠?qū)?-mC轉(zhuǎn)化為5-hmC，但這種酶并未就此罷手，它能夠進(jìn)一步將5-hmC氧化成為5-甲酰胞嘧啶（5-fC），甚至再轉(zhuǎn)化成為5-羧基胞嘧啶（5-caC），這一酶促通路似乎參與了去除DNA 5-mC標(biāo)志的過程，Rosenfeld說。（該通路的更多信息，請(qǐng)參閱Active Motif的DNA甲基化指引手冊(cè)。）

研究以上各種甲基化類型的方法之一就是親和捕獲。標(biāo)準(zhǔn)5-甲基胞嘧啶的傳統(tǒng)研究方法是甲基化DNA免疫沉淀MeDIP和MIRA（methylated CpG island recovery assay），這兩種方法分別利用抗5-mC的抗體和甲基化DNA結(jié)合蛋白（MBD）來捕獲被修飾的DN段。而現(xiàn)在，研究人員也同樣能夠使用特異性抗體對(duì)5-hmC進(jìn)行研究。

目前包括默克密理博在內(nèi)的許多公司都提供抗5-hmC的抗體，Active Motif當(dāng)然也不例外。Active Motif將這種抗體打包在hMeDIP（羥甲基化DNA免疫沉淀）試劑盒中，用來捕獲包含甲基化修飾的DNA序列。除此以外，研究者們還可以使用該公司新品Hydroxymethyl Collector™試劑盒來富集含5-hmC的DN段。（Active Motif也為那些對(duì)5-fC或者5-caC的研究者們提供了相應(yīng)抗體。）

“Hydroxymethyl Collector是我們?nèi)ツ臧l(fā)布的zui引人注目的技術(shù)，”Hondorp說。

Active Motif公司的MethylCollector Ultra™ 試劑盒是利用MBD2b和MBD3L1來純化甲基化的DNA。而Hydroxymethyl Collector試劑盒則不同，它利用了一種酶——beta-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（millipore.html' target='_blank'>Millipore也有相應(yīng)產(chǎn)品提供），這種酶能夠特異性的使5-hmC糖基化。這種被轉(zhuǎn)移的葡萄糖基是經(jīng)歷過疊氮化合物修飾的，它能與*相連，使得Hydroxymethyl Collector試劑盒中的鏈霉親和素磁珠能夠捕獲含5-hmC的DN段。

使用hMeDIP和Hydroxymethyl Collector試劑盒得到的都是是DN段的混合物，其中每條片段中都至少含有一個(gè)5-hmC修飾。研究人員可以對(duì)這一混合物進(jìn)行測(cè)序來得到整個(gè)基因組的羥甲基化信息，或者也可以通過PCR進(jìn)行逐個(gè)位點(diǎn)的分析。當(dāng)然這種混合產(chǎn)物還可以用于芯片分析。專門針對(duì)甲基化研究的芯片包括：美國(guó)安捷倫科技公司的DNA Methylation Human CpG Island芯片和Illumina公司的Infinium® HumanMethylation450 BeadChip等。羅氏NimbleGen也有一款包括10個(gè)芯片的Human DNA Methylation 2.1M Whole-Genome Tiling芯片組合，不過據(jù)羅氏應(yīng)用科學(xué)公司的市場(chǎng)部Clotilde Teiling稱，由于NimbleGen準(zhǔn)備將重心從芯片領(lǐng)域轉(zhuǎn)到序列捕獲產(chǎn)品，該芯片產(chǎn)品將于今年年底停產(chǎn)。

New England Biolab公司的EpiMark® 5-hmC and 5-mC analysis 試劑盒也是同樣利用beta-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)5-hmC進(jìn)行糖基化。不過，這一試劑盒是根據(jù)糖基化后5-hmC和5-mC對(duì)限制性內(nèi)切酶的敏感性不同來進(jìn)行區(qū)分，未糖基化的甲基化位點(diǎn)含有對(duì)MspI（5'-C / CGG-3'）敏感的序列，而糖基化的序列則對(duì)MspI酶不敏感。

此外還有一種特異性識(shí)別5-hmC的酶，限制性內(nèi)切酶PvuRts1I，這種酶Active Motif也有提供。PvuRts1I與含5-hmC的DNA結(jié)合，在相應(yīng)核苷酸位點(diǎn)（9和13）對(duì)雙鏈進(jìn)行切割，得到含5-hmC的24bp片段。用這種酶處理基因組DNA就會(huì)得到上述片段的混合物，對(duì)這種片段混合物進(jìn)行測(cè)序的效果與MeDIP測(cè)序相同，都能夠揭示基因組范圍的5-hmC位點(diǎn)。

重亞硫酸鹽測(cè)序

為了達(dá)到準(zhǔn)確的bp級(jí)分辨率，研究人員還需要采取特殊策略。重亞硫酸鹽測(cè)序是*的甲基化DNA測(cè)序“金標(biāo)準(zhǔn)”。用亞硫酸氫鈉處理DNA能夠?qū)⑽葱揎椀陌奏まD(zhuǎn)化為*，在DNA測(cè)序反應(yīng)中zui后顯示為胸腺嘧啶。將該數(shù)據(jù)與未處理的DNA測(cè)序數(shù)據(jù)相比對(duì)就能夠確定甲基化的位點(diǎn)。

然而，與其他一些甲基化分析方法一樣，重亞硫酸鹽也無法區(qū)分5-mC和5-hmC。不過今年早些時(shí)候，研究者們提出了解決這一難題的兩種方法。

其一是Tet輔助的重亞硫酸鹽測(cè)序TAB-Seq，這種方法利用TET蛋白的活性將5-mC氧化為5-caC。在用亞硫酸氫鈉處理時(shí)，5-caC就像未修飾的胞嘧啶一樣被轉(zhuǎn)化為*。該方法先用beta-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶將5-hmC糖基化保護(hù)起來。隨后用TET處理DNA，使其他甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-caC。zui后再用重亞硫酸鹽處理DNA。在測(cè)序過程中，所有胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶都被讀為T，而5-hmC仍然為C。將這一數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)重亞硫酸鹽測(cè)序生成的數(shù)據(jù)相比，就能使研究人員確定哪個(gè)堿基包含何種修飾。位于芝加哥的WiseGene公司已經(jīng)成功將這一技術(shù)商業(yè)化。

另一種方法是氧化重亞硫酸鹽測(cè)序（oxBS-Seq），用高釕酸鉀將5-hmC氧化為5-fC。在用重亞硫酸鹽處理后，5-fC（就像胞嘧啶）測(cè)序讀取為T。同理，將標(biāo)準(zhǔn)重亞硫酸鹽處理的DNA序列與oxBS-Seq DNA序列相比對(duì)就能夠區(qū)分5-mC與5-hmC。

當(dāng)然，供應(yīng)商們并沒有忽略5-甲基胞嘧啶。用Sturges的話說，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化是“出了名的繁瑣”，需要研究人員把握好試劑、時(shí)間和溫度的平衡，才能將胞嘧啶*轉(zhuǎn)化而又不影響到甲基化胞嘧啶。為此，默克密理博發(fā)布了增強(qiáng)版的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒，CpGenome Turbo Bisulfite Kit。

據(jù)Sturges介紹Turbo kit物如其名，該試劑盒采用新化學(xué)物質(zhì)和優(yōu)化的反應(yīng)溫度，將重亞硫酸鹽16小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化流程縮短到了90分鐘。在內(nèi)部測(cè)試中，這一試劑盒的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了99.9%，并且絲毫沒有發(fā)生過度轉(zhuǎn)化。

定向選擇甲基化DNA

默克密理博公司還發(fā)布了可與Turbo kit配套使用的甲基化DNA富集試劑盒CpG MethylQuest。這種試劑盒用MBD2特異性捕獲含5-甲基胞嘧啶的DNA，并且能夠控制所收集的產(chǎn)物中不含未修飾的堿基或者5-hmC。

安捷倫科技公司也為甲基化DNA的二代測(cè)序提供了一款目標(biāo)富集產(chǎn)品，SureSelect XT Human Methyl-Seq kit試劑盒。該公司基因組學(xué)業(yè)務(wù)部市場(chǎng)副總監(jiān)Yong Yi介紹，與用于目標(biāo)外顯子測(cè)序的SureSelect exome kit類似，該試劑盒能夠有效減少目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序成本和測(cè)序時(shí)間。

“人類全基因組測(cè)序成本高耗時(shí)長(zhǎng)，令不少研究者望而卻步，相比之下外顯子測(cè)序的效率就高多了，”Yi說。“我們將這一理念應(yīng)用于Methyl-Seq試劑盒，使Methyl-Seq實(shí)驗(yàn)更有針對(duì)性。”

羅氏NimbleGen不提供現(xiàn)成的DNA甲基化目標(biāo)富集產(chǎn)品，但用戶可以量體裁衣自行設(shè)計(jì)，公司能夠?yàn)榭蛻魧?.1百萬的探針混合在單個(gè)小管中，Teiling說。

該試劑盒包含120-mer RNA餌，用于捕獲人類基因組CpG島、以及“shores”“ shelves”區(qū)域中的甲基化片段。（Shores和shelves分別是指距CpG島邊緣2kb和4kb的區(qū)域，在這些區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了許多差異性甲基化的序列，Yi說。）該試劑盒總共能夠捕獲3.7百萬CpG超過84Mb序列。而安捷倫的methylation-focused DNA芯片是覆蓋整個(gè)基因組的27,800 CpG島。 “這是相當(dāng)復(fù)雜而全面的設(shè)計(jì)，”Yi說。

當(dāng)然，隨著表觀遺傳學(xué)越來越重要，擴(kuò)展到的領(lǐng)域越來越多，也許您會(huì)被這些五花八門的技術(shù)和方案弄得有些無所適從。不用擔(dān)心，自有公司能為您提供貼心又省心的服務(wù)，這些公司的專業(yè)人員提供的技術(shù)服務(wù)，能為您免去了大量的優(yōu)化工作，節(jié)省寶貴的時(shí)間和精力。舉例來說，Active Motif公司zui近收購(gòu)了GenPathway，這意味著該公司現(xiàn)在能夠提供諸如重亞硫酸鹽測(cè)序、生物信息學(xué)分析、hMeDIP等技術(shù)服務(wù)。“現(xiàn)在我們能夠?yàn)闊o法自己進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析的客戶提供幫助。”Hondorp說。

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