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上海酶聯(lián)生物研究所

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公司動(dòng)態(tài)

蛋白酶抑制劑的選擇

閱讀：1112發(fā)布時(shí)間：2011-8-23

當(dāng)細(xì)胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會(huì)被釋放出來(lái)或被激活，使電泳結(jié)果復(fù)雜化，影響zui終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn)，建議在樣品制備時(shí)盡可能在低溫下進(jìn)行。此外，許多蛋白酶在pH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑。因此對(duì)于我們想要研究的蛋白來(lái)說(shuō)，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對(duì)于蛋白純化路線設(shè)計(jì)來(lái)說(shuō)顯得尤為重要。

蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復(fù)雜的，通常使用許多化學(xué)物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對(duì)某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復(fù)合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒”，見(jiàn)下表（來(lái)自《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》）。

蛋白酶抑制劑有效抑制的酶
PMSF（Pheylmethylsulfonyl fluoride）是很常見(jiàn)的抑制劑，使用濃度為1mmol/L 不可逆抑制*水解酶和一些半*水解酶。
AEBSF *抑制劑，使用濃度為4mmol/L AEBSF的抑制活性與PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低
EDTA，EGTA，使用濃度為1mmol/L 通過(guò)鰲合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子來(lái)抑制金屬蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制劑，使用濃度為2-20ug/ml 亮肽素（Leupeptin）能抑制多種*和半*蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；*（aprotinin）能抑制許多*蛋白酶；苯丁抑制劑（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶
TLCk，TPCK，使用濃度為0.1-0.5mmol/L 不可逆的抑制*和半*的蛋白酶
芐脒（Benzamidine）使用濃度為1-3mmol/L 抑制*蛋白酶

其實(shí)重要的是這種片劑操作方便：只要將一片completeTM 加進(jìn)緩沖液，便可抑制多種不同的蛋白酶，有效地保護(hù)目的蛋白，效果明顯，免除了稱量個(gè)別抑制劑的麻煩。而且complete Lysis 1個(gè)Kit20次反應(yīng)，定價(jià)為2167（Complete Lysis, bacterial II，其它類型價(jià)格差不多），高品質(zhì)，價(jià)格也不高，一舉兩得，何樂(lè)而不為呢？

另外MERCK在抑制劑生產(chǎn)提供方面也實(shí)力雄厚，旗下的各*有一千多種不同用途的抑制劑用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)組、細(xì)胞分化、神經(jīng)生物等諸多領(lǐng)域。其中也包含了分別適用于細(xì)菌、植物、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、重組蛋白、His融合蛋白等不同目的的蛋白酶抑制劑混合物，特異性抑制*蛋白酶或半*蛋白酶活性的抑制劑混合物、堿性磷酸酶抑制劑混合物、酸性及堿性蛋白酶抑制劑混合物等等。

比如用于廣譜蛋白抑制的Protease Inhibitor Cocktail Set I是五種蛋白酶抑制的混合物，廣泛抑制多種不同蛋白酶及酯酶的活力，以凍干粉形式提供（每管以1ml水重溶，即可得1ml的100ⅹ儲(chǔ)液），方便保存。其它有針對(duì)性的蛋白酶抑制劑還有Protease inhibitor cocktail set II（細(xì)菌）、Protease inhibitor cocktail set III, EDTA-free（哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織）、protease inhibitor cocktail set IV（酵母及真菌）、Protease inhibitor cocktail set V, EDTA-free（哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織廣譜*、半*蛋白酶抑制劑）、Protease inhibitor cocktail set VI（植物）和Protease inhibitor cocktail set VII（His融合蛋白純化）。種類繁多，合適于有不同要求的實(shí)驗(yàn)人員。

除此之外，G Biosciences的ProteCEASE™ Protease Inhibitor Cocktails包含了各種經(jīng)過(guò)濃度優(yōu)化后的蛋白酶抑制劑，具有良好的抑制廣泛物種蛋白純化中的蛋白酶活性的作用。ProteCEASE已經(jīng)發(fā)展成為大規(guī)模制備型，具有50ml和100ml的裂解緩沖液中使用的兩種規(guī)格。ProteCEASE分含有EDTA型，用于抑制金屬蛋白酶（metalloprotease）；和不含有EDTA型，用于維持依賴于二價(jià)陽(yáng)離子的蛋白的活性。EDTA-free ProteCEASE型不會(huì)影響使用固相親和層析的蛋白純化，這種方便的形式具有強(qiáng)烈的蛋白抑制作用。

AppliChem GmbH的AEBSF hydrochloride BioChemica通過(guò)磺?；鞍酌富钚灾行牡囊粋€(gè)基團(tuán)，不可逆地抑制*thrombin和其他一些*蛋白酶（chymotrypsin, kallikrein, plasmin, proteinase K, trypsin）。這種試劑是PMSF和DFP的低毒替代品，具有較高的水溶性，溶液狀態(tài)的pH為酸性，所以在這種pH下，穩(wěn)定性較高。

除了蛋白酶抑制劑以外，在許多研究過(guò)程中，尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學(xué)機(jī)制的時(shí)候，需要了解蛋白磷酸化途徑，因此一個(gè)重要的步驟就是準(zhǔn)確的觀察一般和特異的磷酸化狀態(tài)，所以蛋白抽提的另一個(gè)重要保護(hù)過(guò)程就是對(duì)磷酸化狀態(tài)的有效保護(hù)。

磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶），特異性的*/*磷酸酶、*蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對(duì)這種情況羅氏也推出了一種PhosSTOP磷酸酶抑制劑混合片（可以與complete蛋白酶抑制劑兼容），這是一種即用型的片劑，其中的一些磷酸酶抑制劑只需要納摩爾級(jí)的量。無(wú)需花費(fèi)漫長(zhǎng)的時(shí)間尋找合適的磷酸酶，也不必繁瑣的稱量和混合。PhosSTOP可同時(shí)持續(xù)抑制包括酸性和堿性磷酸酶，及*/*蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和*蛋白磷酸酶在內(nèi)的多種磷酸酶。

而且PhosSTOP可應(yīng)用于多種細(xì)胞提取物中磷酸酶的抑制作用，包括對(duì)酸性和堿性磷酸酶，*/*蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和*蛋白磷酸酶的抑制作用。除了有效抑制目的蛋白的去磷酸化，PhosSTOP也不會(huì)影響后繼的蛋白檢測(cè)（例如：western blot）或是蛋白濃度檢測(cè) （例如：BCA或是Bradford）。

當(dāng)然提到磷酸酶抑制劑或者蛋白酶抑制劑，一個(gè)業(yè)內(nèi)*的做得相對(duì)不錯(cuò)的就是默克了，它的磷酸酶抑制劑混合物是以DMSO貯存液的形式，擺脫繁瑣的操作步驟，節(jié)約成本和時(shí)間，在效果方法能有效抑制劑蛋白樣本中的各種磷酸酶（酸性/堿性磷酸酶、絲/*磷酸酶、*磷酸等），配方*公開(kāi)，便于研究人員靈活應(yīng)用。

旗下產(chǎn)品包括：可抑制酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及*磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II，可抑制絲/*磷酸酶及*磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set III，以及可抑制絲/*磷酸酶及堿性磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set IV。

總而言之，在實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)?shù)倪x擇一些經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控的產(chǎn)品，想來(lái)相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復(fù)性，和有效性，讓我們?cè)谙掠螒?yīng)用中得到更潔凈和清晰的結(jié)果。

但是這樣配置溶液進(jìn)行處理，有時(shí)也是頗為麻煩，而且效果可能并不好，目前有一些廠家試劑在簡(jiǎn)便操作，和抑制效果方面有不俗的表現(xiàn)，可以考慮在實(shí)驗(yàn)中選用，節(jié)約時(shí)間和便于結(jié)果分析。

比如，羅氏的Complete蛋白酶抑制劑混合片也許就能滿足這種需要，這種試劑能抑制很多種不同的蛋白酶，包括*蛋白酶、半*蛋白酶及金屬蛋白酶等，而且可應(yīng)用于差不多所有的組織或細(xì)胞提物，包括來(lái)自動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌和直菌的樣品。

除此之外，Complete蛋白酶抑制劑混合片所有成份都穩(wěn)定和無(wú)毒，能提供安全和可靠的保護(hù)，這種混和片有不含EDTA的配方，這樣就更不會(huì)影響依賴金屬的蛋白的活性，并可確保有效進(jìn)行一些純化工作（如應(yīng)用Poly-His）標(biāo)記的蛋白）。

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