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ELISA試劑是怎樣分離純化酶

時(shí)間:2016-8-23閱讀:885
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ELISA試劑是怎樣分離純化酶
常用的鹽析劑是硫酸銨,其溶解度大、價(jià)格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強(qiáng),其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來。對酶沒有破壞作用。
pH的控制:應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮,ELISA試劑在酶等電點(diǎn)時(shí)其溶解度zui小易沉淀,但有些酶再等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差,因此要選擇H值.一般要求在酶zui穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮zui適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定H值后,在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值,要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時(shí)要注意攪拌,并注意硫酸銨的加入速度,一般是由少到多,緩慢加入,硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。
溫度的控制:有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好,ELISA試劑可在常溫下進(jìn)行鹽析操作,而對于大多數(shù)酶,盡可能在低溫下操作。
酶液的凈置:加完硫酸銨后,酶液要靜置一段時(shí)間,使酶蛋白*沉淀下來,酶靜置后,就不要再加以攪拌。
2.有機(jī)溶劑沉淀
ELISA試劑有機(jī)溶劑選擇:可用于酶蛋白沉淀的有機(jī)溶劑包括醇類物質(zhì)等,如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好,可防止蛋白質(zhì)的變性,酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機(jī)溶劑沉淀操作:有機(jī)溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性,當(dāng)溫度較高時(shí)變性蛋白質(zhì)分子就會變成*失活。因此用有機(jī)溶劑處理時(shí)在0℃以下進(jìn)行。用有機(jī)溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久,要盡快加水溶解。
3.聚合物絮凝劑沉淀 聚合物絮凝劑,ELISA試劑如葡聚糖和聚乙二醇,與酶分子爭奪水分子,具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點(diǎn)是在水溶液中,其濃度可達(dá)到50%,濃度為6%-2%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作,而且對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護(hù)作用。聚乙二醇不會被吸附,故在離子交換吸附前不必去除。

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