植物病毒病檢測(cè)方法
植物病毒病是農(nóng)業(yè)上一種重要病害，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量, 目前還沒有1種治療效果較理想的藥劑，對(duì)發(fā)病植株做到早期診斷及提前檢測(cè)就顯得尤為重要。植物病毒學(xué)歷經(jīng)近百年的發(fā)展，植物病毒的檢測(cè)方法與手段也在不斷發(fā)展與改進(jìn)。常用的方法有侵染力測(cè)定法、血清學(xué)方法、電子顯微鏡計(jì)數(shù)和分子生物學(xué)法等。
1.4.1侵染力測(cè)定法
侵染力測(cè)定法是將病毒樣本接種在植物上，根據(jù)侵染力的大小定量。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的，而且是其他定量法的基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)一種新的定量法，如果不經(jīng)過(guò)侵染力的驗(yàn)證，將無(wú)法判斷測(cè)定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力測(cè)定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系統(tǒng)感染率的測(cè)定法等。侵染力測(cè)定多用粗汁液來(lái)接種，為了避免抑制物質(zhì)的作用和使半葉枯斑數(shù)目控制在一定范圍，須用緩沖液稀釋接種物。
局部枯斑法 1929年F.O.Holmes發(fā)現(xiàn)TMV在心葉煙（Nicotiana glutinosa）接種葉片上引起局部壞死斑點(diǎn)，在一定的病毒濃度范圍內(nèi)，所產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)目與病毒濃度成正比例。這一發(fā)現(xiàn)成為病毒侵染性定量測(cè)定的基礎(chǔ)（田波，1987）。所有機(jī)械傳染的病毒都有可能應(yīng)用局部斑點(diǎn)法，但實(shí)際上只有少數(shù)病毒具有可用于定量測(cè)定的局部斑寄主。一個(gè)待測(cè)樣品所形成的斑點(diǎn)數(shù)目除取決于接種物中病毒濃度外，還受試驗(yàn)植物種類、環(huán)境條件和接種物中是否含抑制物質(zhì)的影響。
淀粉－碘斑法 當(dāng)所研究的病毒沒有過(guò)敏性枯斑寄主時(shí)，采用此法。Holmes（1931）發(fā)現(xiàn)TMV接種的煙葉上有時(shí)形成明顯的黃化斑塊，但不能用于計(jì)數(shù)。將這種接種葉用95％乙醇加熱到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色時(shí)，則侵染點(diǎn)處出現(xiàn)淀粉－碘的藍(lán)色反應(yīng)。當(dāng)下午采摘葉片，褪色過(guò)夜，然后用碘液染色，則侵染點(diǎn)較周圍組織著色淺；當(dāng)采摘葉片前，植株先在黑暗中放幾個(gè)小時(shí)，再用碘液染色，則侵染點(diǎn)組織著色深。這是由于病毒侵染既降低光合組織中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物從光合組織中的運(yùn)出。淀粉－碘染色的強(qiáng)弱受環(huán)境條件的影響較大，不如局部枯斑法可靠，但在標(biāo)準(zhǔn)化條件下仍可用于侵染性的定量測(cè)定。
侵染性滴度法 當(dāng)上述方法都不適用時(shí)，可采用侵染性滴度法。即把欲測(cè)定樣品用緩沖液稀釋，可用十倍稀釋、成倍稀釋、半倍稀釋或更低稀釋。這種方法的缺點(diǎn)是需用大量實(shí)驗(yàn)植物，但可得到較好的結(jié)果。此方法可用于介體傳染的病毒。
1.4.2血清學(xué)方法
血清學(xué)方法原理是利用抗原抗體的體外特異性結(jié)合檢測(cè)植物病毒。主要包括沉淀反應(yīng)、凝聚反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫電鏡（IEM）、放射免疫測(cè)定（RIA）、PCR（聚合酶蓮式反應(yīng)）法等。
沉淀反應(yīng) 將可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合，當(dāng)兩者的比例合適，并有鹽類存在時(shí)，即有沉淀物出現(xiàn)，叫做沉淀反應(yīng)。由于沉淀物主要是由抗體球蛋白所組成，為了保證有足夠的抗體，因此試驗(yàn)時(shí)通常要稀釋抗原，不稀釋抗體。
凝聚反應(yīng) 在微生物細(xì)胞懸液中，加入含有特異性抗體的血清，有一定濃度的電解質(zhì)，微生物細(xì)胞凝聚成團(tuán)，叫做凝聚反應(yīng)。分為直接凝聚反應(yīng)與間接凝聚反應(yīng)。由于病毒是可溶性抗原，必須把病毒的抗體先吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)的顆粒表面，然后與相應(yīng)的抗原結(jié)合反應(yīng)。用于吸附抗體的顆粒有皂土、乳膠、炭末、紅細(xì)胞等。