SDS-PAGE “hall of shame”

如果你能夠非常熟練的制備一塊的凝膠，甚至對(duì)它進(jìn)行改進(jìn)都十分困難，那么你真的應(yīng)該值得慶幸！但是如果你不能達(dá)到這個(gè)水平也不要灰心。所有的的科學(xué)家都是從失敗中成長(zhǎng)起來(lái)的，事實(shí)上，如果不出錯(cuò)我們就很難學(xué)到更多的東西?。ㄎ业膚estern blot技術(shù)也是從上百次的失敗中成熟起來(lái)的，這中間我就學(xué)到了很多，相對(duì)于PCR，我*次就成功的做出了RT-PCR和重疊延伸PCR，但是對(duì)于PCR我能說(shuō)的真的很少！）這本“失誤大全”包括了過(guò)去實(shí)驗(yàn)室中許多學(xué)生包括老師跑的zui“爛”的膠，它們代表了人們?cè)谂苣z是zui容易犯的多種錯(cuò)誤（當(dāng)然這些錯(cuò)誤仍在更新之中）?？茨阕约旱哪z缺陷也許并不能很好的解決問(wèn)題，至少不是zui的解決方式，本文用圖例指出你可能在哪一些方面改進(jìn)你的技術(shù)。

評(píng)價(jià)你的膠找出你的癥狀并和這個(gè)小冊(cè)子收集的實(shí)例比對(duì)。每一個(gè)例子都配有完整的凝膠圖像和與之相對(duì)的解釋及建議。從這本“失誤大全”中你應(yīng)該能夠找到解決你的問(wèn)題的正確的方法。

*部分：涂抹痕跡（smears）

涂抹痕跡可能由于多種原因引起，但是zui常見(jiàn)的原因是聚丙烯酰胺凝膠倒膠的不均勻或者上樣量過(guò)大。這塊膠倒膠不正確，在上部膠倒入制膠槽之前就已經(jīng)發(fā)生聚合。首先倒入的膠聚合發(fā)生的太快了。與其重新倒膠，不如停止倒膠重新準(zhǔn)備新的聚丙烯酰胺混合液，然后將新的膠倒入舊膠的上方。但是顯然這種連接不是非常牢固。（我推薦重新倒膠，制膠很關(guān)鍵，如果你后續(xù)還要做blot，膠沒(méi)有跑好浪費(fèi)太多了！）查看全文


第二部分：條帶過(guò)淺

這個(gè)問(wèn)題可能是由于加樣孔成形不佳和/或凝膠加樣不認(rèn)真所致。背景較深而且不均一說(shuō)明蛋白可能存在于電泳緩沖液中。zui有可能原因是由于裝置沒(méi)有正確緊密的裝配導(dǎo)致較多的樣品溢出加樣孔。溢出的樣品很可能不會(huì)重新溶入形成條帶，因?yàn)檫@些蛋白從上層緩沖液的間隔持續(xù)進(jìn)入凝膠。查看全文

第三部分：前端指示劑缺失

為了裝置凝膠花了不少功夫，如果停止電泳太晚就太可惜了。因?yàn)槿绻糠智岸说闹甘緞┮呀?jīng)跑出凝膠的話就不能確定各個(gè)條帶相對(duì)應(yīng)的遷移率了。這塊膠有一個(gè)內(nèi)部的刻度——也就是跑膠時(shí)帶上了分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）。由于條帶較平直，任意條帶都可以作為參考來(lái)確定跑膠的遷移率。查看全文  

第四部分：過(guò)早終止電泳

很明顯這塊膠的指示劑前端位于什么位置。仍有繼續(xù)電泳的空間可以把條帶分得更開(kāi)以增加分辨率。相對(duì)遷移率是為了分析凝膠相同位置上相同大小的蛋白。隨著蛋白遷移距離的增加分辨率逐漸增高直到彌散限制了分辨率的繼續(xù)提高。查看全文

第五部分：混在因素

這個(gè)問(wèn)題的凝膠在整個(gè)“失誤大全”中到處可見(jiàn)。這是由于分離膠的表面不平所造成的，因此當(dāng)樣品濃縮之后所有的條帶都變扭曲的形狀。扭曲的條帶也可以見(jiàn)于電場(chǎng)的不均一，但是這種條帶的扭曲應(yīng)該是對(duì)稱的。