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當(dāng)前位置:上海西格生物科技有限公司>>PCR相關(guān)試劑>>克隆相關(guān)>> pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

參  考  價:780
具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)
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20T 780元 15盒可售

更新時間:2024-05-22 09:20:01瀏覽次數(shù):248次

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貨號 XG-P3032 規(guī)格 20T
包裝 盒裝 用途 僅供科研研究實驗
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pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

貨號

規(guī)格

分類

XG-P3032

20T

克隆相關(guān)

描述:pUC57 Simple 通用克隆載體采用了 TOPO 酶連接技術(shù),載體預(yù)先偶聯(lián)上 TOPO 酶,當(dāng)加入 PCR 擴增產(chǎn)物后,5 min 就可以完成連接反應(yīng),連接陽性率高。pUC57 Simple 通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點,便于后續(xù)亞克隆。該產(chǎn) 品適用于 Taq 酶擴增的含“A"尾巴和高保真酶擴增的 PCR 產(chǎn)物的連接,載體含有氨芐青霉抗性篩選標(biāo)記。 

注意:RTS DH5α 凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下,可于-20℃長期保存(>2 年),已經(jīng)溶解后,請-60℃以下保存(3 個月)。
主要特征
(1)快速連接,僅需 5min;(2)操作簡單,僅需加入載體和片段即可;(3)無需藍白斑篩選,陽性率高;(4)不包含
任何酶切位點,便于后續(xù)亞克?。?)平末端和 A 尾產(chǎn)物通用。
注意:引物不能磷酸化。
測序引物
正向測序引物:M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’;
反向測序引物:M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’;
操作步驟
1. PCR 產(chǎn)物的純化
1.1 PCR 擴增完畢后,電泳檢測產(chǎn)物,如無非特異性擴增、無引物二聚體、條帶單一明亮,則可采用 PCR 產(chǎn)物純化試劑
盒純化后用于連接。產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以進行連接,但效果稍差一些。
1.2 PCR 擴增完畢后,電泳檢測產(chǎn)物,如有非特異性擴增條帶或引物二聚體,則必須采用膠回收后用于連接。
1.3 PCR 擴增模板來源于 Amp 抗性質(zhì)粒,則必須采用膠回收后用于連接。
2. PCR 用量和連接時間
PCR 產(chǎn)物大小 PCR 產(chǎn)物用量 載體用量 摩爾比 連接時間 陽性率
0.1~1kb 2~10ng 1 μl 1: 5~10 5~10min >95%
1~3kb 10~20ng 1 μl 1: 5~10 15~20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 連接反應(yīng)
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下試劑
成 分 用 量
PCR 產(chǎn)物 0.5~4 μl (用量參考上表)
pUC57 Simple Vector 1 μl
加無菌水至總體積為 5 μl
輕輕吹打混合均勻后,室溫(25°C)孵育 5~30min,通常放置 10min。
關(guān)于 PCR 產(chǎn)物的用量說明:在 PCR 產(chǎn)物回收后(在無法進行 NanoDrop 測定濃度的情況下),按照一般的經(jīng)驗可估算產(chǎn)物
的用量,原則為:3 μl 回收產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后,可清晰判斷的情況下,使用 0.5~1 μl 回收產(chǎn)物(約 5~15 ng)進行連
接即可?;厥债a(chǎn)物難以觀察的情況下使用 4 μl 回收產(chǎn)物(約 5~10 ng)進行連接。使用過高量的 PCR 產(chǎn)物將會導(dǎo)致連接效
率低下,長斑數(shù)量和陽性率急劇下降。


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一、模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;

二、引物:PCR反應(yīng)的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;

三、dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;

四、Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;

五、PCR buffer溶液:對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;

六、酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;


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①Oligo dT
選擇Oligo dT時,要求RNA必須有Poly A,所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT,對RNA樣品的質(zhì)量要求較高,不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng),建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT,尤其適合模板豐度很低的情況(比如某個gene表達量很低)。選擇隨機引物時,鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板,然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系,一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng,如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng,可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物(<500bp)的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物(GSP)是某個基因序列的一部分,與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合,每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此,當(dāng)分析多種目標(biāo)時,則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同,所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物,建議對退火溫度進行優(yōu)化。

pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

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