酵母人工染色體載體

    酵母人工染色體載體（ＹＡＣ）是由ＣＥＮ載體發(fā)展而來(lái)的。它的主要組成如下：

（１）著絲粒；

（２）兩個(gè)端粒：存在于染色體的末端，使染色體正確地結(jié)束復(fù)制，防止染色體被外切酶切割；

（３）復(fù)制起始位點(diǎn)。ELISA試劑盒

    ＤＮＡ復(fù)制的起點(diǎn)染色體結(jié)構(gòu)確定后，可以通過(guò)重組ＤＮＡ技術(shù)將每一組成部分分離開(kāi)來(lái)，然后連接在一起，創(chuàng)造人工染色體。自然中酵母的染色體有幾百個(gè)ｋｂ長(zhǎng)度，利用人工染色體可以攜帶比其他質(zhì)粒更大的ＤＮＡ分子。

    ｐＹＡＣ３是在ｐＢＲ３２２的基礎(chǔ)上，插入了幾個(gè)酵母基因。其中兩個(gè)基因是ＵＲＡ３和ＴＲＰ１，可以作為選擇標(biāo)記分別存在于ＹＩｐ５和ＹＲｐ７，就像在ＹＲｐ７中一樣，攜帶ＴＲＰ１的同時(shí)也包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，但在ｐＹＡＣ３中這一片段擴(kuò)展到ＣＥＮ４，它是一段來(lái)自４號(hào)染色體著絲粒的ＤＮＡ片段。ＴＲＰ１ｏｒｉＣＥＮ４片段已經(jīng)包含了人工染色體組成三部分中的兩部分。第三部分端粒，有兩段稱為ＴＥＬ的序列提供，并不是它們自身組成端粒序列，而是在引入酵母細(xì)胞核后，作為種子序列建立端粒。還有zui后一部分沒(méi)有提到的是ＳＵＰ４，它在克隆實(shí)驗(yàn)中作為插入片段的選擇標(biāo)記基因。利用ｐＹＡＣ３克隆的策略是，載體首先被ＢａｍＨⅠ和ＳｎａＢⅠ酶切將分子切成三塊，ＢａｍＨⅠ片段被去掉，剩下兩個(gè)臂，每一臂都以ＴＥＬ作為末端，另一端是ＳｎａＢⅠ位點(diǎn)。克隆的ＤＮＡ必須是平端（ＳｎａＢⅠ也是一個(gè)平端酶，識(shí)別序列是ＴＡＣＧＴＡ），被連接在兩個(gè)臂的中間就產(chǎn)生了人工染色體。利用原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法將人工染色體引入酵母。受體酵母是利用一個(gè)雙營(yíng)養(yǎng)缺陷體ｔｒｐ１-ｕｒａ３，載體上含有互補(bǔ)基因作為選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化后于基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有含有人工染色體的細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)。含有兩個(gè)左臂或者兩個(gè)右臂的染色體都不能正常生長(zhǎng)，因?yàn)槠渲幸粋€(gè)選擇標(biāo)記基因丟失，插入片段的鑒定可以通過(guò)ＳＵＰ４基因的插入失活，白色的克隆是重組子，紅色的不是。ELISA試劑盒

    一些哺乳動(dòng)物的基因大于１００ｋｂ（如人類膀胱纖維基因有２５０ｋｂ），超過(guò)了大腸桿菌載體系統(tǒng)的承受范圍，但正好在ＹＡＣ載體的范圍之內(nèi)。zui近的研究發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，ＹＡＣ可以在哺乳動(dòng)物中表達(dá)，因此可以研究哺物動(dòng)物基因的功能。

    ＹＡＣ在構(gòu)建基因文庫(kù)中非常重要，要知道，zui高容量的大腸桿菌質(zhì)粒可以插入３００ｋｂ的片段，對(duì)于人的基因文３００００個(gè)克隆，而ＹＡＣ可以克隆６００ｋｂ的片段，一些特殊的類型可以攜帶１４００ｋｂ片段，可以使人類基因文庫(kù)的克隆數(shù)降至６５００個(gè)。但不幸的是，這樣的“ｍｅｇａ-ＹＡＣ”存在著不穩(wěn)定性，克隆的ＤＮＡ片段可以被重新排列。不管怎樣，ＹＡＣ在大規(guī)模的測(cè)序中（例如人類基因組計(jì)劃）是非常有用的。ELISA試劑盒