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雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒說明書

閱讀:387發(fā)布時間:2016-5-9

雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒說明書

測定意義

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計算。此外,可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。

測定原理

強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲于SuSO4形成紫色絡(luò)合物:紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量。該方法測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì),適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品,尤其是動物材料。

自備一起和用品

可見分光光度計、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一:液體×1 瓶 4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1 瓶,5 mg/mL,4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取

1、液體樣品:澄清無色液體樣品可以直接測定。

2、組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液(自備,根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)冰浴勻漿,10000rpm,4℃離心10min,取上清,即待測夜。(動物樣品常常需要稀釋)。

3、細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min):然后10000rpm,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。

測定

1、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長到540nm,蒸餾水調(diào)零。

2、空白管:取1mL玻璃比色皿,加入200uL蒸餾水,1000uL試劑一,混勻后室溫靜置15min,于540nm比色,記為A空白管。

3標(biāo)準(zhǔn)管:取1mL玻璃比色皿,加入200uL標(biāo)準(zhǔn)液,1000uL試劑一,混勻后室溫靜置150min,于540nm比色,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4、測定管:去1mL玻璃比色皿,加入200uL待測夜,1000試劑一,混勻后室溫靜置15min,于540nm比色,記為A測定管。

樣品中蛋白質(zhì)濃度計算

C待測(mg/mL)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管- A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)=5×(A測定管- A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)

注意事項(xiàng):

1、樣品蛋白濃度須在 1~10mg/ml范圍內(nèi)低于1mg/ml能用法高于10mg/ml須做相應(yīng)稀釋因測定前用1~2個樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)確保蛋白濃度在1~10mg/ml范圍內(nèi)

2待測樣品蛋白提可用生理鹽水、雙蒸水或含蛋白的 PBS 提該法硫酸Tris 緩沖液干擾提液中應(yīng)含這些物質(zhì)否則改用 BCA 蛋白質(zhì)含測定試劑盒


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