氨基-比林-N-去甲基化酶AND測(cè)試盒_P450系列
測(cè)定方法：分光光度法
產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：細(xì)胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。
氨基-比林-N-去甲基化酶AND測(cè)試盒_P450系列
測(cè)定原理：
AND催化氨基-比林釋放甲醛，通過(guò)Nash比色法測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出AND活性。
自備儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、蒸餾水、無(wú)水乙醇和冰。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50mL蒸餾水充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶（棕色瓶），4℃避光保存。臨用前加入2.6 mL無(wú)水乙醇，充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.6 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水10mL充分溶解。
試劑六：液體×1瓶，室溫保存。
試劑七：液體×1瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5 mL EP 管，加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛-溶液，4℃保存。
粗酶液提?。?br/>
1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。
AND活性測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 對(duì)照管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃
水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A對(duì)照管。
4. 測(cè)定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。
5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1支EP管，加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
注意：每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。
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