乙醛酸循環(huán)系列_檸檬酸合酶(CS)測試盒
測定方法：微量法
產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣
注 意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點之一。
測定原理：
CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶 A，進一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應促使無色的 DTNB 轉變成的 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體 100mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體 20mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體 1.5mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 28mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 1.2mL 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；
乙醛酸循環(huán)系列_檸檬酸合酶(CS)測試盒
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
①稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿 600g，4℃離心 5min。
③棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
④上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）。
⑤在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體 CS 測定。
測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
（1）在試劑五中加入 0.6mL 無水乙醇和 13mL 試劑四，混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
（2）測定管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、220μL 試劑五和 10μL 試劑六，混勻，37℃反應 15min 后立即測定吸光值 A1。
（3）對照管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、220μL 試劑四和 10μL 試劑六，混勻，37℃反應 15min 后立即測定吸光值 A2。（4）計算 ΔA=A1-A2，每個測定管設一個對照管。
環(huán)保在線