乙醛酸循環(huán)系列_順烏頭酸酶(ACO)測(cè)試盒
測(cè)定方法：微量法
產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。
測(cè)定原理：
ACO 催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將 NAD+ 還原生成 NADH，導(dǎo)致 340nm 處光吸收上升。
乙醛酸循環(huán)系列_順烏頭酸酶(ACO)測(cè)試盒
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：20mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：1.5mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加 1.5mL 蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用試劑七：粉劑×1 支，4°保存；臨用前加 12mL 試劑四充分溶解；
工作液：臨用前在 12mL 試劑七中加入 1mL 蒸餾水、1mL 試劑四、1mL 試劑五、1mL 試劑六充分混勻
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi) 600g，4℃離心 5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
4、上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。
5、在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）將工作液，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內(nèi)可用。
（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 40μL 樣本 160μL 工作液，混勻，立即記錄 340nm
處20s 時(shí)的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。 ACO 活性計(jì)算
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