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上海雅吉生物科技有限公司

酶切實驗技術(shù)

時間:2015-1-21閱讀:655
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酶切可以:(1)獲得粘性末端進(jìn)行連接;(2)用于驗證DNA重組是否成功;(3)用于驗證質(zhì)粒酶切位點是否有效。
實驗方法
酶切
實驗方法原理     采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進(jìn)行酶切以獲得相應(yīng)的粘末端進(jìn)行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單,但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同(主要是鹽離子濃度不同)或反應(yīng)溫度不同,這時可以采用如下措施解決:1)先用一種酶切,然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切;2)*行低鹽要求的酶酶切,然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應(yīng)要求,加入第二種酶進(jìn)行酶切;3)使用通用緩沖液進(jìn)行雙酶切。具體要根據(jù)酶的反應(yīng)要求進(jìn)行,盡量避免星號活力。
實驗材料    質(zhì)粒DNA
試劑、試劑盒    限制性核酸內(nèi)切酶蒸餾水
儀器、耗材    微量移液槍離心機(jī)電泳儀水浴鍋紫外透射觀測儀離心管記號筆
實驗步驟    
一、實驗材料準(zhǔn)備 
 
1.  材料:質(zhì)粒DNA。
 
2.  試劑:限制性內(nèi)切酶、ddH2O。
 
3 .  儀器:微量移液槍,離心機(jī),水浴鍋, 電泳儀,紫外透射觀測儀。
 
二、單酶切 

1.  在1.5 mL滅菌離心管中依次加入:

(1)質(zhì)粒DNA:X μL(約1 μg)。

(2)限制性內(nèi)切酶:1 μL(約10 U)。

(3)10×buffer:2 μL。

(4)ddH2O:補足20 μL。

2.  混勻,做好標(biāo)記。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反應(yīng)。

5.  電泳檢測酶切效果。

三、雙酶切 

1.  在1.5 mL滅菌離心管中依次加入:

(1)質(zhì)粒DNA:X μL(約1 μg)。

(2)限制性內(nèi)切酶1:1 μL(約10 U)。

(3)限制性內(nèi)切酶2:1 μL(約10 U)

(3)10×buffer:1或2 μL。

(4)ddH2O:補足20 μL。

2.  混勻,做好標(biāo)記。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反應(yīng)。

5.  電泳檢測酶切效果。

四、結(jié)果與分析 

假若一種酶在環(huán)狀質(zhì)粒DNA中只有一個酶切位點, 且酶切*,紫外燈下檢測電泳結(jié)果,則單酶切應(yīng)為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數(shù)目多于理論值,那么有可能是酶切不*。如果酶切結(jié)果與酶切前的質(zhì)粒條帶一樣(超螺旋、線性和開環(huán)三條帶),則說明質(zhì)粒*沒有被切開。
收起 
注意事項    
1. 酶切的選擇原則一般是盡量擴(kuò)大酶切體系,這樣抑制因素得以稀釋;基因組DNA或質(zhì)粒DNA酶的用量較一般DNA大,一般為1μg/10U;所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10,否則甘油濃度會超過5%,會產(chǎn)生星號活力;對難切的質(zhì)?;蚧蚪MDNA應(yīng)延長反應(yīng)時間4―5hr, 甚至。滅活限制性內(nèi)切酶活性可以采用加熱滅活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具體每一種酶可能有些方法不能*滅活,這一點需要注意。

2.  雙酶切體系緩沖液添加量要根據(jù)兩種限制性內(nèi)切酶*緩沖體系,可以登錄限制性內(nèi)切酶購買公司查看。

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