與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針"是抗體，“顯色"用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

Western Blotting 實(shí)驗(yàn)試劑

1

30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亞甲丙烯酰胺 將30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，查證該溶液pH應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存。 小心：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過(guò)皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能含有少量未聚合材料。

2

4×Tris·Cl/SDS, pH8.8, 在300mlH2O中溶解91g Tris堿(1.5mol/L)，用1mol/L調(diào)節(jié)pH至8.8, 補(bǔ)加H2O至體積500ml。用0.45um濾膜過(guò)濾溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

3

4×Tris·Cl/SDS, pH6.8, 在40mlH2O中溶解6.05g Tris堿(0.5mol/L)，用1mol/L調(diào)節(jié)pH至6.8, 補(bǔ)加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過(guò)濾溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。

4

4×sds電泳緩沖液 Tris base 24.2 g Glycerin 115.3 g 20%SDS 20 ml 加水至總體積1000ml。 應(yīng)用時(shí)稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。

5

TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。

6

10%過(guò)硫酸銨 過(guò)硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基?？捎萌ルx子水配制小量10%(w/v)的貯存液并保存于4℃。由于過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。

1)按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。

2)按表7.1配制分離膠液體并脫氣，然后加入10%的過(guò)硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。

表7.1 聚丙烯酰胺分離膠的配制

試劑成分

配制不同濃度分離膠所需試劑(ml)

5% 8% 10% 12% 15%

Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50

4×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75

H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75

10%過(guò)硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

按所需分離的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用于60～200kDa的SDS變性蛋白質(zhì)分子的分離，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。

3)用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入于玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少于10μl不需灌制積層膠。

4)用另一根巴斯德吸管，先從一邊的墊片，再?gòu)牧硪贿厜|片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇(厚約1cm)。讓凝膠在室溫聚合30min。 聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問(wèn)題在于過(guò)硫酸按或TEMED，或兩者都有。

5)傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸干。

6)按表7.2配制積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。

表7.2 聚丙烯酰胺積層膠的配制

GEL%(3.9%) Total (10.05ml)

Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml

4×Tris·Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml

H2O 6.10 ml

10%過(guò)硫酸銨 0.05 ml

TEMED 0.01 ml

7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時(shí)，再補(bǔ)加積層膠液體充盈剩余空間。讓積層膠室溫聚合30min。

8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，于100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質(zhì)沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之，并同樣在100℃煮沸5-10min。按供應(yīng)商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物。

對(duì)于0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過(guò)20μl 為宜。用考馬斯亮藍(lán)染色法顯跡，成分很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。采用銀染顯跡時(shí)，樣品用量可減小10～100倍(按樣品的復(fù)雜程度在小于20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等)。

2×SDS加樣緩沖液(loading buffer)配制：

成 分 體積 (ml)

0.5M Tris·Cl (pH6.8) 12.5

20%SDS 11.5

Glycerin 10

2% Blue-Bromo-phenol 2.5

β-mercaptoethanol * 5.0

加H2O至總體積50 ml，分裝

*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。

9)小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，并以此緩沖液充滿之。10)按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室(上槽)，同時(shí)往下緩沖液室(下槽)加入推薦量的1×SDS電泳緩沖液。

11)將固定于上槽的凝膠板放入下槽中，并往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。

12)用帶平嘴針頭的50μl注射器將同樣濃度的蛋白質(zhì)樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對(duì)照孔加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴(kuò)散。

13)再往上槽加入余下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。

14)連接電源，對(duì)于0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍(lán)染料從積層膠進(jìn)入分離膠，再將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止。

15)關(guān)閉電源并撤去連接的導(dǎo)線，棄去電泳緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。

16)將凝膠定位以便識(shí)別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來(lái)，放在一疊吸水紙或紙巾上。

17)小心將封邊的墊片抽出一半，并以此為杠桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來(lái)。

18)小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認(rèn)出加樣次序，接著就可進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

19)轉(zhuǎn)膜

將凝膠面與負(fù)極相連，硝酸纖維素膜與正極相連。(100V，1小時(shí))要放于4℃。英文

1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations

20)、清洗 將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。搖床搖動(dòng)。(這步忘了!)

21)、封閉 1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediay place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20). 2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃. 22)、一抗孵育 一抗用TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時(shí)，(或4℃)搖床搖動(dòng)。 Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.

23)、清洗 將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。

24)、二抗孵育 二抗用TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時(shí)，搖床搖動(dòng)。

25)、清洗 同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分鐘，以洗去膜上的Tween 20，因?yàn)樗梢宰璧K底物的沉積。

26)、顯色 按如下配方配制顯色液： 1mL水+1滴(大約50微升)試劑A(之后混勻)+1滴試劑B+1滴試劑C 將硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，立即放入去離子水中終止反應(yīng)。