血球計數(shù)板計數(shù)誤差的來源及解決方案 ——自動化計數(shù)

引言

血球計數(shù)板一直是實驗室細(xì)胞計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。自從18世紀(jì)在法國*次被用于分析病人的血液樣本，血球計數(shù)板在過去幾百年中已經(jīng)得到一系列的重大發(fā)展，相比以前計數(shù)更為、使用更為簡單，并zui終形成了今天我們使用的樣子。現(xiàn)在血球計數(shù)板計數(shù)仍然是所有細(xì)胞學(xué)研究的一個組成部分，然而其計數(shù)存在的問題由于自身固有的設(shè)計和使用方法并沒有隨著時間而消失。我們在這里將要列出造成血球計數(shù)板計數(shù)誤差的來源， 并將討論自動化計數(shù)是如何消除這些問題的。

血球計數(shù)板計數(shù)誤差的來源

1. 人工失誤(混勻、加樣、稀釋、計算錯誤以及人工操作誤差)

a. 在對5個操作者的觀察中，操作錯誤和隨機錯誤分別占3.12%和7.8%[3]。

b. James M. Ramsey做了一項實驗，衡量取樣區(qū)和稀釋系數(shù)如何影響計數(shù)的準(zhǔn)確性。

他測試了3個取樣區(qū)面積(18, 9和4 mm2)及兩個稀釋系數(shù)(1:100 和 1:25)。取樣面積減小時CVs值是升高的，稀釋倍數(shù)的升高會降低CVs[4]。

 c. Bane 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同一個操作者去對同樣的兩份液樣品計數(shù)時，計數(shù)結(jié)果的差異55%歸因于取樣和移液問題， 45%歸因于計數(shù)室和細(xì)胞計數(shù)問題 [5]。 Freund和Carol 展開的另外一項實驗表明，不同操作者之間的計數(shù)差異能高達(dá)52%，而同一個操作者的計數(shù)差異為20%[5]。

2. 多次計數(shù)以保證結(jié)果準(zhǔn)確性的必要性

a. 1907年， John C. DaCosta 聲明，為了得到的計數(shù)結(jié)果，很有必要取血液樣品中的多滴血液分別進(jìn)行計數(shù)[1]。

b. Nielsen, Smyth和Greenfield得出結(jié)論， 為了得到10%, 15%和 20%的血球計數(shù)板計數(shù)準(zhǔn)確性, ，必需的樣品數(shù)分別為7份, 3份和2份,每份樣品中分別包含180個, 200個和125個細(xì)胞[6]。

c. 1881年， Lyon 和Thoma推測血球計數(shù)板的標(biāo)準(zhǔn)誤差為 ,其中n即計數(shù)的細(xì)胞數(shù)目。

d. 1907年, William Sealy以“學(xué)生”的名義發(fā)布了他計數(shù)釀啤酒師的酵母的工作，他特地通過實驗和數(shù)學(xué)模型計算了計數(shù)誤差，公式也為[7,8]。

3. 細(xì)胞均勻分布的要求

a. 1912年， James C. Todd將細(xì)胞分布不均勻列為計數(shù)誤差的問題來源[1]。

b. 學(xué)生也說有兩項主要的計數(shù)誤差來源，一為吸取的酵母樣品不能夠代表原液的濃度，另一個是隨機取樣時細(xì)胞在計數(shù)區(qū)域分布不均勻[7,8]。

c. 1947年, 一篇文章提到血球計數(shù)板中的細(xì)胞濃度分布不均勻問題。zui初的結(jié)果顯示，離進(jìn)樣口zui近和zui遠(yuǎn)區(qū)域的濃度分別比平均濃度低3.5%和高3.5%[9]。

4. 儀器及材料差異(柵格，深度，蓋玻片，緩沖液類型以及移液器) 

a. 結(jié)果顯示計數(shù)室的計數(shù)誤差和移液器（CV%）造成的計數(shù)誤差分別在大約4.6% 和4.7%[10]。

b. 在一項5個計數(shù)人員的計數(shù)實驗中，移液器和血細(xì)胞計數(shù)器造成的誤差分別為9.46% 和4.26%[3]。

c. 1961年, Sanders和Skerry得出結(jié)論，蓋玻片的位置能造成7.6%的計數(shù)差異[11]。 

d. 在關(guān)于不同稀釋步驟的計數(shù)實驗中，隨著稀釋步驟的增加，變異系數(shù)升高，每個血細(xì)胞計數(shù)系統(tǒng)的誤差如下： Bürker-Türk (BT) (7.7%-12%), Thoma (6.6%-14.1%), Makler (19.8%-23.6%)[12]。

解決血球計數(shù)板的計數(shù)問題

隨著新技術(shù)的發(fā)展，如計算機技術(shù)、自動化軟件、光學(xué)鏡片、熒光染料、精密制造，以及現(xiàn)代技術(shù)如熒光顯微技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、圖像細(xì)胞術(shù)，自動化已經(jīng)解決了血球計數(shù)板存在的許多問題[13-25]。

自動化計數(shù)解決：

人工操作誤差 - 為了解決這個問題，自動化和機器人技術(shù)能夠代替人工的樣品操作和計數(shù)操作。

加樣誤差 - 取樣區(qū)越多、計數(shù)細(xì)胞越多，隨機誤差越小，但是需要時間越多。通過應(yīng)用自動取樣或者成像技術(shù)，成千上百萬的細(xì)胞能在很短時間內(nèi)被分析，提高了效率，并把分析中的隨機誤差降到zui低。 

移液和稀釋誤差 - 這些取決于操作者的操作經(jīng)驗。通過采用自動加樣器或者自動液流系統(tǒng)，這個誤差可以被降到zui低[26]。

材料誤差 - 計數(shù)室的誤差是由于不同品牌的血球計數(shù)板或者同一品牌不同批次間的差異造成的。這也可以通過自動細(xì)胞計數(shù)儀（細(xì)胞計數(shù)儀的選擇，請查閱 《細(xì)胞計數(shù)儀的選擇》一文）增加取樣量及減小隨機誤差來解決。

細(xì)胞分布不均勻 – 血球計數(shù)板不合適的清洗，或者蓋玻片放置不正確將會產(chǎn)生誤差。這些可以通過不使用計數(shù)室的細(xì)胞計數(shù)儀來消除，比如流式細(xì)胞儀。但是細(xì)胞樣品中若是存在細(xì)胞團，基于液流計數(shù)的儀器將很難計數(shù)，而使用圖像計數(shù)儀，細(xì)胞團可以使用圖像分析算法計數(shù)聚集的細(xì)胞，這樣可以提高細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性。

綜述

血球計數(shù)板幾百年來在生物醫(yī)學(xué)研究中一直都是一個*的工具，并且經(jīng)歷了很多的改進(jìn)形成了今天研究者們使用的樣子，然而它仍然會造成很多不可避免的計數(shù)誤差。今天，現(xiàn)代化的自動細(xì)胞計數(shù)儀的使用已經(jīng)很大程度上消除了許多出現(xiàn)誤差的來源，提高了細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性和效率。