細胞生物學實驗技術(shù)  北京雅安達生物技術(shù)有限公司

組織化學和細胞化學染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于對某些細胞成分進行定性和定位研究。
（一）固定
物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。
化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。
（二）顯示方法
金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物zui終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。
Schiff反應(yīng)：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。
聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。
脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。
茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。
二、免疫細胞化學 immunocytochemistry
概念：根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。常用的標記物有熒光素和酶。
免疫熒光法（immunofluorescent technique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。
酶標免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。
三、顯微光譜分析技術(shù)
細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。
可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。
四、放射自顯影術(shù)
用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。
原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。
一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。
14C半衰期為5730年，3H為12.5年。
五、分子雜交技術(shù)
具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。
（一）原位雜交（in situ hybridization）。
用于檢測染色體上的特殊DNA序列。zui初是使用帶放射性的DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。
（二）Southern雜交
是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。
將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。
六、PCR 技術(shù)
PCR即：polymerase chain reaction。
反應(yīng)體系：①樣品DNA；②引物（primer），約15-20個核苷酸；③4種dNTP；④Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermus aquaticus，zui適作用溫度75~80℃，短時間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。
反應(yīng)過程：①變性：約90-95℃；②復性：約60℃左右；③延伸：70-75℃；④重復 “變性——復性——延伸” 過程20-30次循環(huán)。