干細胞培養(yǎng)

近年來，干細胞不止是生命科學和醫(yī)學研究的熱點，也常是人們茶余飯后的談資。從*否決干細胞研究法案到黃禹錫造假風波，干細胞研究總是占據(jù)報紙的大幅版面。為什么這么熱門？因為干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，有望用來修復(fù)那些被疾病和創(chuàng)傷所破壞的各種各樣的細胞和組織，從而為多種慢性疾病的治療帶來了希望，例如帕金森病、老年癡呆癥、糖尿病、心血管疾病，甚至癌癥。

干細胞根據(jù)細胞來源的不同，可分為胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時，內(nèi)層細胞團（Inner Cell Mass）的細胞即為胚胎干細胞。胚胎干細胞具有性，可以自我更新并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。進一步說，胚胎干細胞（ES細胞）是一種高度未分化細胞。它具有發(fā)育的性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。成體干細胞是指存在于組織中的未分化細胞，該種細胞能夠自我更新并能夠分化形成組成該類組織的細胞，包括間充質(zhì)細胞、造血干細胞、神經(jīng)干細胞等。成年動物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力，成體干細胞在其中起著關(guān)鍵的作用。然而與胚胎干細胞不同的是，這種干細胞在培養(yǎng)時生存時間有限制并且只能分化成有限的幾種細胞類型。

目前干細胞有幾百種之多，而且它們的培養(yǎng)特性也各異，就重復(fù)性而言，干細胞培養(yǎng)領(lǐng)域還面臨著極大的困難。為干細胞提供一個*的培養(yǎng)條件，尤其是保證細胞處于未分化狀態(tài)或者在需要的時候使細胞向?qū)Ｒ坏姆较蚍只歉杉毎芯恐衵ui大的挑戰(zhàn)。

干細胞的培養(yǎng)
zui初的胚胎干細胞培養(yǎng)都少不了小鼠胚胎成纖維（MEF）細胞制備的滋養(yǎng)層。MEF向培養(yǎng)基中分泌一些未知因子，能支持干細胞生長。后來，研究人員發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)小鼠ES 細胞時，向培養(yǎng)基中添加白血病抑制因子（LIF）可以代替滋養(yǎng)層細胞而維持ES 細胞的自我更新能力，但LIF并不能維持人類胚胎干細胞（hESC）的未分化狀態(tài)（北京雅安達生物技術(shù)有限公司）。因此大部分實驗室還在使用細胞滋養(yǎng)層。然而，MEF細胞在體外的增殖能力較差，且隨著傳代次數(shù)增加，其支持hESC生長的能力降低，需要不斷地制備原代MEF細胞，昂貴、費時（北京雅安達生物技術(shù)有限公司）。而且鼠源性的MEF可能引起動物源性病原體或支原體的污染，因此很多研究組嘗試用各種人源細胞直接作為飼養(yǎng)層。但也不是所有人源細胞都能很好地支持hESC的生長，而且用異體來源的細胞仍存在一定的交叉污染危險?；谶@些原因，研究人員希望能開發(fā)出無滋養(yǎng)層、無血清、成分確定的hESC培養(yǎng)體系。

BD生物科學公司、加拿大StemCell公司就和的WiCell研究所建立了戰(zhàn)略合作關(guān)系，開發(fā)出更優(yōu)化、無滋養(yǎng)層的人胚胎干細胞培養(yǎng)環(huán)境，包括成分確定的無血清培養(yǎng)液和合適的培養(yǎng)基質(zhì)。

StemCell公司優(yōu)化了WiCell 研究所的mTeSR 1培養(yǎng)液配方，并將其商品化。mTeSR 1培養(yǎng)液是一種*、成分確定的無血清培養(yǎng)液。在BD公司Matrigel 基質(zhì)上，mTeSR 1可用于未分化狀態(tài)hESC的維持和擴增，而不必添加其他生長因子。在mTeSR 1中未分化的hESC保持多能標記如Oct-3/4和SSEA-3的高表達。在畸胎瘤測定中，hES可分化成三種胚層的能力也證明了其多能性。

hESC理想的培養(yǎng)環(huán)境包括無血清及成分確定的培養(yǎng)液和一個適合hESC生長的培養(yǎng)表面。BD的Matrigel 基質(zhì)大家應(yīng)該都聽說過吧，是一種從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠惡性腫瘤基膜分離的再生基膜，主要成分是層粘蛋白、IV型膠原和蛋白糖苷肝素硫酸鹽，還包含了生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等。BD公司在此基礎(chǔ)上開發(fā)了一種更適合hESC生長的優(yōu)化表面——Matrigel hESC-qualified Matrix，能與StemCell公司的mTeSR 1相匹配，為hESC研究提供了必需的重復(fù)性和一致性。mTeSR 1和BD Matrigel™ 基質(zhì)的結(jié)合使用可培養(yǎng)各種WiCell hESC多至20代。

Invitrogen也推出了StemPro hESC SFM——一種*確定的無血清培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)人胚胎干細胞。它已經(jīng)證明能在一系列hESC中維持細胞的多能性。Geltrex matrix則是與StemPro hESC SFM配套使用的基質(zhì)（北京雅安達生物技術(shù)有限公司）。它的主要成分與Matrigel類似，但簡化了生長因子，使批次間穩(wěn)定性提高，并模擬了體內(nèi)的環(huán)境，為細胞培養(yǎng)提供了一種3D腳手架，使細胞真正感到賓至如歸。另外，Invitrogen還推出了*用于人類胚胎干細胞培養(yǎng)的*確定的基質(zhì)——CELLstart。它不含細胞來源成分，可以支持hESC貼壁和擴增，并維持多能性和分化能力。CELLstart也能用于間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)干細胞。

Invitrogen公司還推出STEMPRO MSC SFM，專門用于間充質(zhì)干細胞（MSC）或來源于骨髓的干細胞的培養(yǎng)。它是*限定的，意味著培養(yǎng)基中的每一種成分都是已知量的，因而排除了顯著的批間差。這種培養(yǎng)基能使MSC維持未分化狀態(tài)超過9代，而用傳統(tǒng)的加血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞在5代后就開始出現(xiàn)分化。

但也不是所有的干細胞都喜歡無血清培養(yǎng)基，有些在無血清培養(yǎng)基中生長緩慢，狀態(tài)不佳。這時，你也可以有別的選擇，譬如血清替代物或特別的血清。Thermo Scientific HyClone就提供了AdvanceSTEM Serum Replacement和ES-Qualified FBS，適合于支持胚胎干細胞的生長。除此之外，賽默飛世爾科技還與CET達成協(xié)議為研究人員提供多種人源成體干細胞、生長培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基（北京雅安達生物技術(shù)有限公司）。對所有的CET干細胞都確認了已知的基質(zhì)細胞，干細胞和造血細胞標記。并且每一個系統(tǒng)都用流式細胞儀進行了分析并且確保純度>95%。所有的干細胞都經(jīng)過測試并且保證HIV-1, HIV-2, B型肝炎和C型肝炎均為陰性。所有的CET干細胞在銷售之前僅在不含有任何額外生長因子的培養(yǎng)基和血清中生長，這樣可以使分化的可能性降低。它還與Primogenix公司達成協(xié)議，為研究者提供小鼠胚胎干細胞：129/X1和B6N。

這些都是賽默飛世爾干細胞計劃（Stem Cell Excellence Program）的一部分。這個干細胞產(chǎn)品線除了Thermo Scientific HyClone AdvanceSTEM試劑、試劑盒和干細胞系外，還包括Dharmacon*的RNAi技術(shù)；Nalgene和Nunc的高品質(zhì)塑料制品；Sorvall, Heraeus, Forma和Revco久經(jīng)考驗的實驗室儀器；Barnstead的純水；以及Nautilus LIMS軟件和Matrix自動移液操作產(chǎn)品。這些產(chǎn)品將用于干細胞研究的多個方面，包括干細胞收集和制備、擴增和分化、鑒定和分析、以及儲存和運輸。

R&D公司也推出了神經(jīng)干細胞的擴增試劑盒，用于神經(jīng)干細胞在無血清培養(yǎng)基中的體外擴增。每個試劑盒中除了N2添加劑外，還包含了促進神經(jīng)前體細胞增殖的生長因子，如bFGF、EGF等。另外，R&D還有造血干細胞的生長因子組，包含促進HSC體外擴增的多個生長因子——Flt-3 Ligand, SCF, 和Tpo。

干細胞的分化
干細胞研究人員面臨的另一重大挑戰(zhàn)就是使細胞正確分化，也就是分化成你想要的細胞類型。賽默飛世爾科技就有一系列AdvanceSTEM 分化試劑盒，能將間充質(zhì)干細胞快速分化成脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞。不久前，它還推出了AdvanceSTEM神經(jīng)分化試劑盒，專門用于支持間充質(zhì)干細胞分化成神經(jīng)細胞。分化后的神經(jīng)細胞可用于研究多種包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病。該試劑盒包括包含有特異生長因子的細胞培養(yǎng)基以及生長添加劑，該生長因子能夠促使干細胞分化。在加入到需要分化的干細胞之前僅需要將培養(yǎng)基及添加劑混合即可。Invitrogen也推出了STEMPRO Adipogenesis和 STEMPRO Osteogenesis分化試劑盒。這些試劑盒包含了培養(yǎng)基和特殊的添加劑，能誘導(dǎo)MSC分化形成脂肪細胞或骨細胞，讓研究者去研究MSC如何分化成多種組織類型。

還有許多工具讓研究人員來檢測分化。一向以抗體見長的R&D就有多種檢測干細胞分化的抗體。Invitrogen還有一個名為BG01V/hOG的細胞系，用GFP報告基因來監(jiān)測分化。在細胞處于多潛能狀態(tài)時，啟動子Oct4具有活性，細胞就會表達GFP。這樣研究者可以很容易觀察到細胞的分化，而不用做基因或蛋白表達分析。

分化也可以通過追蹤與細胞狀態(tài)相關(guān)的標記來檢測。人類胚胎干細胞在分化和未分化的狀態(tài)，表現(xiàn)出*的早期分化標記。Invitrogen的STEMPRO® EZChek Human Tri-Lineage Multiplex PCR Kit可以檢測hESC的早期分化標記（Oct4, AFP, ACTC1, and Sox1）。這個試劑盒可在一個PCR反應(yīng)中快速檢測細胞的分化狀態(tài)和分化成三胚層細胞的可能性。

干細胞研究的*目標是臨床上的細胞移植治療。要達到這樣的高度，干細胞的培養(yǎng)必須滿足穩(wěn)定、標準化、無污染、長期培養(yǎng)后染色體保持穩(wěn)定狀態(tài)這些先決條件。雖然目前還無法達到這些條件，但各研究機構(gòu)和廠商都在這個領(lǐng)域都投入了大量的研究精力，相信在不久的將來，干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)將會為臨床應(yīng)用鋪平道路。