干細(xì)胞培養(yǎng)

近年來(lái)，干細(xì)胞不止是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，也常是人們茶余飯后的談資。從*否決干細(xì)胞研究法案到黃禹錫造假風(fēng)波，干細(xì)胞研究總是占據(jù)報(bào)紙的大幅版面。為什么這么熱門？因?yàn)楦杉?xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，有望用來(lái)修復(fù)那些被疾病和創(chuàng)傷所破壞的各種各樣的細(xì)胞和組織，從而為多種慢性疾病的治療帶來(lái)了希望，例如帕金森病、老年癡呆癥、糖尿病、心血管疾病，甚至癌癥。

干細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞來(lái)源的不同，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩大類。當(dāng)受精卵分裂發(fā)育成囊胚時(shí)，內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)（Inner Cell Mass）的細(xì)胞即為胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有性，可以自我更新并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。進(jìn)一步說(shuō)，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）是一種高度未分化細(xì)胞。它具有發(fā)育的性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。成體干細(xì)胞是指存在于組織中的未分化細(xì)胞，該種細(xì)胞能夠自我更新并能夠分化形成組成該類組織的細(xì)胞，包括間充質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。成年動(dòng)物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力，成體干細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵的作用。然而與胚胎干細(xì)胞不同的是，這種干細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)生存時(shí)間有限制并且只能分化成有限的幾種細(xì)胞類型。

目前干細(xì)胞有幾百種之多，而且它們的培養(yǎng)特性也各異，就重復(fù)性而言，干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域還面臨著極大的困難。為干細(xì)胞提供一個(gè)*的培養(yǎng)條件，尤其是保證細(xì)胞處于未分化狀態(tài)或者在需要的時(shí)候使細(xì)胞向?qū)Ｒ坏姆较蚍只?，是干?xì)胞研究中zui大的挑戰(zhàn)。

干細(xì)胞的培養(yǎng)
zui初的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)都少不了小鼠胚胎成纖維（MEF）細(xì)胞制備的滋養(yǎng)層。MEF向培養(yǎng)基中分泌一些未知因子，能支持干細(xì)胞生長(zhǎng)。后來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)小鼠ES 細(xì)胞時(shí)，向培養(yǎng)基中添加白血病抑制因子（LIF）可以代替滋養(yǎng)層細(xì)胞而維持ES 細(xì)胞的自我更新能力，但LIF并不能維持人類胚胎干細(xì)胞（hESC）的未分化狀態(tài)（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）。因此大部分實(shí)驗(yàn)室還在使用細(xì)胞滋養(yǎng)層。然而，MEF細(xì)胞在體外的增殖能力較差，且隨著傳代次數(shù)增加，其支持hESC生長(zhǎng)的能力降低，需要不斷地制備原代MEF細(xì)胞，昂貴、費(fèi)時(shí)（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）。而且鼠源性的MEF可能引起動(dòng)物源性病原體或支原體的污染，因此很多研究組嘗試用各種人源細(xì)胞直接作為飼養(yǎng)層。但也不是所有人源細(xì)胞都能很好地支持hESC的生長(zhǎng)，而且用異體來(lái)源的細(xì)胞仍存在一定的交叉污染危險(xiǎn)?；谶@些原因，研究人員希望能開(kāi)發(fā)出無(wú)滋養(yǎng)層、無(wú)血清、成分確定的hESC培養(yǎng)體系。

BD生物科學(xué)公司、加拿大StemCell公司就和的WiCell研究所建立了戰(zhàn)略合作關(guān)系，開(kāi)發(fā)出更優(yōu)化、無(wú)滋養(yǎng)層的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，包括成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)液和合適的培養(yǎng)基質(zhì)。

StemCell公司優(yōu)化了WiCell 研究所的mTeSR 1培養(yǎng)液配方，并將其商品化。mTeSR 1培養(yǎng)液是一種*、成分確定的無(wú)血清培養(yǎng)液。在BD公司Matrigel 基質(zhì)上，mTeSR 1可用于未分化狀態(tài)hESC的維持和擴(kuò)增，而不必添加其他生長(zhǎng)因子。在mTeSR 1中未分化的hESC保持多能標(biāo)記如Oct-3/4和SSEA-3的高表達(dá)。在畸胎瘤測(cè)定中，hES可分化成三種胚層的能力也證明了其多能性。

hESC理想的培養(yǎng)環(huán)境包括無(wú)血清及成分確定的培養(yǎng)液和一個(gè)適合hESC生長(zhǎng)的培養(yǎng)表面。BD的Matrigel 基質(zhì)大家應(yīng)該都聽(tīng)說(shuō)過(guò)吧，是一種從Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠惡性腫瘤基膜分離的再生基膜，主要成分是層粘蛋白、IV型膠原和蛋白糖苷肝素硫酸鹽，還包含了生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等。BD公司在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了一種更適合hESC生長(zhǎng)的優(yōu)化表面——Matrigel hESC-qualified Matrix，能與StemCell公司的mTeSR 1相匹配，為hESC研究提供了必需的重復(fù)性和一致性。mTeSR 1和BD Matrigel™ 基質(zhì)的結(jié)合使用可培養(yǎng)各種WiCell hESC多至20代。

Invitrogen也推出了StemPro hESC SFM——一種*確定的無(wú)血清培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞。它已經(jīng)證明能在一系列hESC中維持細(xì)胞的多能性。Geltrex matrix則是與StemPro hESC SFM配套使用的基質(zhì)（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）。它的主要成分與Matrigel類似，但簡(jiǎn)化了生長(zhǎng)因子，使批次間穩(wěn)定性提高，并模擬了體內(nèi)的環(huán)境，為細(xì)胞培養(yǎng)提供了一種3D腳手架，使細(xì)胞真正感到賓至如歸。另外，Invitrogen還推出了*用于人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的*確定的基質(zhì)——CELLstart。它不含細(xì)胞來(lái)源成分，可以支持hESC貼壁和擴(kuò)增，并維持多能性和分化能力。CELLstart也能用于間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。

Invitrogen公司還推出STEMPRO MSC SFM，專門用于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）或來(lái)源于骨髓的干細(xì)胞的培養(yǎng)。它是*限定的，意味著培養(yǎng)基中的每一種成分都是已知量的，因而排除了顯著的批間差。這種培養(yǎng)基能使MSC維持未分化狀態(tài)超過(guò)9代，而用傳統(tǒng)的加血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在5代后就開(kāi)始出現(xiàn)分化。

但也不是所有的干細(xì)胞都喜歡無(wú)血清培養(yǎng)基，有些在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，狀態(tài)不佳。這時(shí)，你也可以有別的選擇，譬如血清替代物或特別的血清。Thermo Scientific HyClone就提供了AdvanceSTEM Serum Replacement和ES-Qualified FBS，適合于支持胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)。除此之外，賽默飛世爾科技還與CET達(dá)成協(xié)議為研究人員提供多種人源成體干細(xì)胞、生長(zhǎng)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）。對(duì)所有的CET干細(xì)胞都確認(rèn)了已知的基質(zhì)細(xì)胞，干細(xì)胞和造血細(xì)胞標(biāo)記。并且每一個(gè)系統(tǒng)都用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了分析并且確保純度>95%。所有的干細(xì)胞都經(jīng)過(guò)測(cè)試并且保證HIV-1, HIV-2, B型肝炎和C型肝炎均為陰性。所有的CET干細(xì)胞在銷售之前僅在不含有任何額外生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基和血清中生長(zhǎng)，這樣可以使分化的可能性降低。它還與Primogenix公司達(dá)成協(xié)議，為研究者提供小鼠胚胎干細(xì)胞：129/X1和B6N。

這些都是賽默飛世爾干細(xì)胞計(jì)劃（Stem Cell Excellence Program）的一部分。這個(gè)干細(xì)胞產(chǎn)品線除了Thermo Scientific HyClone AdvanceSTEM試劑、試劑盒和干細(xì)胞系外，還包括Dharmacon*的RNAi技術(shù)；Nalgene和Nunc的高品質(zhì)塑料制品；Sorvall, Heraeus, Forma和Revco久經(jīng)考驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室儀器；Barnstead的純水；以及Nautilus LIMS軟件和Matrix自動(dòng)移液操作產(chǎn)品。這些產(chǎn)品將用于干細(xì)胞研究的多個(gè)方面，包括干細(xì)胞收集和制備、擴(kuò)增和分化、鑒定和分析、以及儲(chǔ)存和運(yùn)輸。

R&D公司也推出了神經(jīng)干細(xì)胞的擴(kuò)增試劑盒，用于神經(jīng)干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的體外擴(kuò)增。每個(gè)試劑盒中除了N2添加劑外，還包含了促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子，如bFGF、EGF等。另外，R&D還有造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)因子組，包含促進(jìn)HSC體外擴(kuò)增的多個(gè)生長(zhǎng)因子——Flt-3 Ligand, SCF, 和Tpo。

干細(xì)胞的分化
干細(xì)胞研究人員面臨的另一重大挑戰(zhàn)就是使細(xì)胞正確分化，也就是分化成你想要的細(xì)胞類型。賽默飛世爾科技就有一系列AdvanceSTEM 分化試劑盒，能將間充質(zhì)干細(xì)胞快速分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。不久前，它還推出了AdvanceSTEM神經(jīng)分化試劑盒，專門用于支持間充質(zhì)干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞。分化后的神經(jīng)細(xì)胞可用于研究多種包括帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病。該試劑盒包括包含有特異生長(zhǎng)因子的細(xì)胞培養(yǎng)基以及生長(zhǎng)添加劑，該生長(zhǎng)因子能夠促使干細(xì)胞分化。在加入到需要分化的干細(xì)胞之前僅需要將培養(yǎng)基及添加劑混合即可。Invitrogen也推出了STEMPRO Adipogenesis和 STEMPRO Osteogenesis分化試劑盒。這些試劑盒包含了培養(yǎng)基和特殊的添加劑，能誘導(dǎo)MSC分化形成脂肪細(xì)胞或骨細(xì)胞，讓研究者去研究MSC如何分化成多種組織類型。

還有許多工具讓研究人員來(lái)檢測(cè)分化。一向以抗體見(jiàn)長(zhǎng)的R&D就有多種檢測(cè)干細(xì)胞分化的抗體。Invitrogen還有一個(gè)名為BG01V/hOG的細(xì)胞系，用GFP報(bào)告基因來(lái)監(jiān)測(cè)分化。在細(xì)胞處于多潛能狀態(tài)時(shí)，啟動(dòng)子Oct4具有活性，細(xì)胞就會(huì)表達(dá)GFP。這樣研究者可以很容易觀察到細(xì)胞的分化，而不用做基因或蛋白表達(dá)分析。

分化也可以通過(guò)追蹤與細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)。人類胚胎干細(xì)胞在分化和未分化的狀態(tài)，表現(xiàn)出*的早期分化標(biāo)記。Invitrogen的STEMPRO® EZChek Human Tri-Lineage Multiplex PCR Kit可以檢測(cè)hESC的早期分化標(biāo)記（Oct4, AFP, ACTC1, and Sox1）。這個(gè)試劑盒可在一個(gè)PCR反應(yīng)中快速檢測(cè)細(xì)胞的分化狀態(tài)和分化成三胚層細(xì)胞的可能性。

干細(xì)胞研究的*目標(biāo)是臨床上的細(xì)胞移植治療。要達(dá)到這樣的高度，干細(xì)胞的培養(yǎng)必須滿足穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)化、無(wú)污染、長(zhǎng)期培養(yǎng)后染色體保持穩(wěn)定狀態(tài)這些先決條件。雖然目前還無(wú)法達(dá)到這些條件，但各研究機(jī)構(gòu)和廠商都在這個(gè)領(lǐng)域都投入了大量的研究精力，相信在不久的將來(lái)，干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)將會(huì)為臨床應(yīng)用鋪平道路。