溫度梯度凝膠電泳

【資料簡(jiǎn)介】

在檢測(cè)點(diǎn)突變的電泳技術(shù)中，溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）是zui近出現(xiàn)的一種方法。zui先是將這種技術(shù)應(yīng)用到DNA、RNA的分子構(gòu)象分析、序列變異分析以及核酸、蛋白質(zhì)的相互作用研究中，并將其逐漸發(fā)展為成熟的分子生物學(xué)技術(shù)。
一、TGGE分析原理
傳統(tǒng)的電泳分離方法基于分子的大小和帶電荷數(shù)的多少，TGGE則增加了一個(gè)新的分離參數(shù)，即分子構(gòu)象。穩(wěn)定的構(gòu)象由氫鍵和范德華力共同維系，并受環(huán)境溫度、鹽離于濃度、pH值等因素影響。如果環(huán)境溫度升高到某一限定點(diǎn)就可以破壞氫鍵和范德華力，這時(shí)分子即處于變性狀態(tài)，此過程就稱為熱變性。TGGE就是利用不同構(gòu)象的分子具有不同的變性溫度（Tm）來進(jìn)行分離釣。在正常情況下，DNA分子呈雙鏈結(jié)構(gòu)狀態(tài)；當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)，DNA雙鏈開始解開，由完整的雙鏈變?yōu)榉植骐p鏈；如果溫度繼續(xù)升高，DNA雙鏈*解開，變?yōu)閱捂淒NA。這種分子構(gòu)象的改變會(huì)影響分子在電泳時(shí)的遷移行為，因?yàn)镈NA雙鏈的打開直接導(dǎo)致遷移率下降。這種影響在兩條鏈即將*解開時(shí)zui大，此時(shí)分子的電泳速度zui慢；而當(dāng)全部形成單鏈時(shí)，泳動(dòng)速度會(huì)變快。以一個(gè)雜合位點(diǎn)Aa來說，突變型aa與野生型AA相比只存在單堿基改變。在對(duì)雜合子個(gè)體Aa進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，其PCR產(chǎn)物混合液中有4種組分：AA、aa、A（Waston鏈）a（Crick鏈）和a（Waston鏈）A（Crick鏈）4種不同構(gòu)象的DNA雙鏈，它們的分子質(zhì)量相同但Tm值各不相同。在進(jìn)行TGGE時(shí)，異源雙鏈Aa和aA因存在不配對(duì)堿基而zui先變性，同源雙鏈AA和aa則因?yàn)閴A基組成不同表現(xiàn)為不同的變性行為（GC堿基對(duì)有3個(gè)氫鍵，AT堿基對(duì)只有2個(gè)氫鍵）。這樣，4種Tm不同的雙鏈DNA的遷移率各不相同，zui后形成4條位置不同的泳帶。
二、TGGE實(shí)驗(yàn)裝置和操作方法
TGGE分析是一種新的水平式PAGE電泳方法。根據(jù)TGGE溫度梯度方向與電泳方向是否一致可以進(jìn)行兩種模式的TGGE：①垂直TGGE，其溫度梯度方向與電泳方向垂直，可用于優(yōu)化樣本的分離條件，也可用于分析PCR產(chǎn)物的組成。②平行TGGE，其溫度梯度方向與電泳方向一致，一般采用優(yōu)化后的電泳條件，可用于同時(shí)分析多個(gè)樣本。
目前市場(chǎng)上已有商品化的實(shí)驗(yàn)裝置，如德國(guó)Biometra公司的產(chǎn)品TGGE sysrem。該系統(tǒng)包括3部分：電泳單元（溫度梯度板和電泳槽），微處理控制器（整合有電源功能）和常用附件（玻板、電極紙和膠聯(lián)膜）。溫度梯度板兩端的溫度設(shè)定值決定溫度梯度的線性范圍?？刂破鲃t可通過編程控制溫梯板的升溫時(shí)間、升溫速率及電泳溫度條件，并可將運(yùn)行參數(shù)不間斷顯示出來。兩個(gè)可移動(dòng)的緩沖液槽可以隨意放置，進(jìn)行兩種電泳模式的安裝轉(zhuǎn)換。
TGGE的操作過程和常見的單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）有些相似，但更易于控制實(shí)驗(yàn)條件，操作也更方便?；静僮鞑襟E為：電泳系統(tǒng)安裝，溫度梯度編程，樣本制備，PAGE凝膠灌制及上樣，TGGE電泳及電泳后染色。與其他電泳方法一樣，PAGE凝膠的制備、剝離及上樣是TGGE分析中技巧性的操作，也是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。該系統(tǒng)中關(guān)于灌膠的新穎設(shè)計(jì)使這一工作變得輕松易行。首先是玻板設(shè)計(jì)，可根據(jù)需要選擇不同齒突數(shù)的玻板，帶齒玻板在凝膠形成的同時(shí)也形成加樣孔，這樣避免了插入和拔出加樣梳的煩瑣操作。其次是膠聯(lián)膜的使用。一面疏水、另一面親水的膠聯(lián)膜可使膠液只在膠聯(lián)膜與帶齒突玻板間進(jìn)行聚合，膠聯(lián)膜的支持作用還可保證凝膠在剝?nèi)r(shí)不會(huì)破爛。使用電極紙作為電橋連接凝膠與電泳緩沖液，簡(jiǎn)化了凝膠安裝過程。
TGGE系統(tǒng)具有以下特點(diǎn)：①分辨率高，溫度梯度由微處理器控制，線性極為嚴(yán)格。2mm的距離zui大可對(duì)應(yīng)0．6℃的溫度差，即使分子間的解鏈溫度（Tm）差異極細(xì)微也可以檢測(cè)出來。②加樣品量小，1～5mg的DNA或RNA上樣品量即可達(dá)到清晰的電泳分離效果。③重現(xiàn)性好，電泳條件（如溫度、時(shí)間等）易于控制，可以保證電泳的重現(xiàn)性和結(jié)果的重復(fù)性。④節(jié)約時(shí)間，小面積溫度梯度板和小尺寸凝膠（74cmX82cm），只需要2．5ml凝膠溶液。電泳可在30min至1h內(nèi)完成。
三、TGGE技術(shù)的應(yīng)用
TGGE技術(shù)的zui大特點(diǎn)是具有高分辨能力，能夠100％檢出只存在單堿基差異的突變個(gè)體。該方法還具電泳條件易于控制、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，所以這種方法出現(xiàn)以后很快就得到廣泛的應(yīng)用，包括用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究的腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、群體分析和RNA研究等領(lǐng)域。
對(duì)人類疾病基因的突變，或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物突變個(gè)體的檢測(cè)，或者對(duì)某些未知基因突變的篩選，都需要這種檢測(cè)或篩選方法能夠檢出所有可能發(fā)生的突變情況。為此，Riesner等設(shè)計(jì)了一種特別的PCR—TGGE方法。與野生型相比，突變型因?yàn)閴A基序列發(fā)生改變，導(dǎo)致TGGE電泳條帶的位置改變，并且條帶位置因突變位置的不同而不同。這種條帶位置的改變可根據(jù)熱動(dòng)力學(xué)統(tǒng)計(jì)方程計(jì)算出來，從而確定突變發(fā)生的位置。如果要確定標(biāo)本中某特異DNA或RNA序列的數(shù)量，則可采用定量PCR-TGGE方法。針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)的內(nèi)參照序列與靶基因之間只存在特定位點(diǎn)的單堿基改變，將已知拷貝數(shù)的內(nèi)參照與標(biāo)本中的靶基因共同擴(kuò)增。TGGE分離兩者的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)兩者的擴(kuò)增比率就可以確定標(biāo)本中靶基因的拷貝數(shù)。
在人類遺傳病和腫瘤基因研究中，PCR—TGGE也得到廣泛應(yīng)用。Horn采用TGGE方法對(duì)I型神經(jīng)纖維瘤（NFl）患者進(jìn)行普查，發(fā)現(xiàn)了NFl基因的3個(gè)新突變。隨著對(duì)各種遺傳病和腫瘤分子病理學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)的遺傳病和腫瘤相關(guān)基因日益增多，TGGE技術(shù)將會(huì)得到更多的應(yīng)用。另外，TGGE方法也可用于蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性研究，以及溫度敏感蛋白質(zhì)（如酶類）的分離與鑒定分析。