細胞轉染細胞的穩(wěn)定篩選

2012年06月13日 17:13:09人氣：1943來源：上海都宜生物科技有限公司

細胞轉染細胞的穩(wěn)定篩選

1．確定抗生素作用的*濃度：不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預試驗，確定抗生素對所選擇細胞的zui低作用濃度。

① 提前 24 小時在 96 孔板或 24 孔板中接種細胞 8 孔，接種量以第二天長成 25%單層為宜，置 CO2 孵箱中 37℃培養(yǎng)過夜。

② 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml）。

③ 培養(yǎng) 10-14 天以絕大部分細胞死亡濃度為準,一般為 400-800μg/ml，篩選穩(wěn) 定表達克隆時可比該濃度適當提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半。

2．轉染按前面的步驟進行。

3．轉染 72 小時后按 1: 10 的比例將轉染細胞在 6 孔板中傳代，換為含預試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內可見單個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。

① 濾紙片法：用消毒的 5x5mm 濾紙片浸過*，將濾紙片貼在單細胞集落上 10-15 秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于 24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細胞在 24 孔板中長滿后轉入 25cm2 培養(yǎng)瓶中，長滿后再轉入 75cm2 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

② 有限稀釋法：將細胞消化下來后做連續(xù)的 10 倍稀釋（10-2-10-10），將每一稀釋度的細胞滴加到 96 孔板中培養(yǎng)，7- 10 天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。

4. ELISA或 Westernblot檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量zui高的克隆傳代并保種。

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