1. Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)

2. Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒

3. 所有的PCR反應均在Eppendorf Mastercycler-gradient梯度PCR儀上進行。

擴增目標：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。

模板RNA：從人HELA細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度從1μg遞減至10pg。

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)，標準一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應總體積50μl

cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產物產量動力學范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。

擴增目標：5.3 kb 的人結節(jié)性腦硬化因子(hTSF)mRNA 片段。

模板RNA：從人HELA 細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度為100 ng 和10 ng。

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對長模板的特殊RT－PCR 方案。

應用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測到5.3 kb 的hTSF PCR 產物。這個PCR 反應非常困難，大多數(shù)RT－PCR 試劑盒生產廠家從未發(fā)布過應用一步法方案，有效擴增類似長度模板的結果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩(wěn)定可靠地從10 ng HELA 細胞RNA 中擴增該產物。

兩步法RT－PCR 的擴增目標：

500 bp 的(鼠和人)α微管蛋白mRNA 片段

1.3kb 的(鼠和人)腫瘤壞死因子受體(TNFR1)mRNA 片段

5.3 kb 的人結節(jié)性腦硬化因子(hTSF)mRNA 片段

12.3 kb 的鼠動力蛋白mRNA 片段

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產品說明書中的針對普通長度模板和較長模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉錄反應均采用0.5μg 的Oligo(dT)20 引物為引物。

注：動力蛋白的逆轉錄孵育時間延長至90 分鐘。

* -- 微管蛋白

** -- TNFR1

對5 種不同表達水平的基因進行RT－PCR。為了得到zui高的靈敏度，RT 和PCR 反應分開進行。如圖3 所示，對于α微管蛋白和TNFR1，我們可以應用兩步法RT－PCR 方法并將退火和延伸步驟合并為進行一次68℃ 孵育。如圖3 所示，無論片段長度大小和拷貝數(shù)高低，所有反應都可以順利進行。即使對于動力蛋白這種特別長(達12.3 kb)的稀有轉錄本，用cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)也能夠進行有效擴增，而且結果具有的重復性，表明即使對于困難的RT－PCR 反應， Eppendorf 試劑盒也能獲得可靠結果。

cMaster RT 系統(tǒng)是為了給所有的RT 和RT－PCR 應用提供zui大的靈活性而設計的。該試劑盒結合了重組的同二聚體病毒逆轉錄酶和*的RTplusPCR 反應緩沖液系統(tǒng)，可以在較寬的溫度范圍(37℃－60℃)和0.2kb-12.5kb產物大小范圍內進行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶活性，校正功能輔助的保真性和高延伸效率。應用于一步法中，可以靈敏地檢測到極少量的總RNA 并擴增出長達5.3 kb的cDNA。兩步法方案可以從RT 反應中擴增多個目的cDNA，PCR產物的片段長度可增加至12.3 kb。 其他的擴展應用：系統(tǒng)的逆轉錄部分即cMaster RT 可以與任何PCR系統(tǒng)合用或者為其他下游應用如雜交實驗合成cDNA 探針。