上海永葉生物科技有限公司作者
核酸分為兩大類:一類為核糖核酸(RNA),另一類為脫氧核糖核酸(DND)。核酸的分子量極大,人數(shù)萬致億萬。核酸是兩性化合物,在一定的等電點。溶于水,其水溶液呈酸性,不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內(nèi)的核酸常和蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白在不同濃度的電解質(zhì)溶液中的溶解度有顯著區(qū)別,有一定濃度范圍的氯化鈉溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度隨著氯化鈉濃度增加而逐漸下降,當氯化鈉濃度為0.14mol/L時,其溶解度僅為水中溶解度的1/100,但當氯化鈉濃度再增加時,脫氧核糖核蛋白的溶解度重新增加,氯化鈉濃度增加到0.5mol/L時,其溶解度與水中溶解度相似,當氯化鈉濃度增加到1mol/L時,它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化鈉溶液中仍有相當大的溶解度,因此常用0.14mol/L氯化鈉溶液提取核糖核蛋白,而提取脫氧核糖核蛋白時,則用1mol/L氯化鈉溶液。兩種核糖核蛋白的溶解度與溶液的pH也有關(guān)。當pH為4.2時,脫氧糖核蛋白的溶解度zui低,而pH為2.0~2.5時,核糖核蛋白的溶解度zui低。所以調(diào)節(jié)氯化鈉溶液的濃度和pH值,可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開來。
(1)RNA的提?。篟NA在細胞中主要有三種類型,即rRNA(核微粒核糖核酸)、tRNA(轉(zhuǎn)移核糖核酸)和mRNA(信使核糖核酸)。mRNA代謝極不穩(wěn)定,提取時要求條件較嚴格;tRNA當細胞破碎后,用酸處理得到“pH5”沉淀,即可從中分離tRNA;rRNA占全部RNA的80%以上,比較穩(wěn)定,一般提取的大分子RNA主要為此部分。核內(nèi)rRNA常先將細胞核分離后,再進行提取,可避免其他細胞組分RNA的干擾。
RNA的提取,通常是用0.14mol/L氯化鈉溶液將組織做勻漿并反復(fù)提取細胞質(zhì)中的核糖核蛋白,而留下含有DNA的細胞核物質(zhì),然后用10%醋酸調(diào)至pH4.2沉淀,離心棄去上清液,先用0.5mol/L氯化鈉溶液,后用水洗滌沉淀,將核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L*溶液中,離心,取上清液,調(diào)pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌,再一次除去脫氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白質(zhì)可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去,核酸留在*水溶液中,加入乙醇,RNA即以鈉鹽形式沉淀出來。
提取RNA另一類方法,不須事先用0.14mol/L氯化鈉提取核糖核蛋白,而一步將RNA的蛋白質(zhì)分開,并同時把RNA抽提出來,此類方法是在破碎細胞做成勻漿時,加入去污劑十二烷基磺酸鈉或二甲苯磺酸鈉;而現(xiàn)在zui常用的方法是直接加入含水*與勻漿一起振蕩,DNA和蛋白質(zhì)沉淀于酚層中,水層中含RNA和多糖,然后用乙醇使RNA沉淀,四種物質(zhì)一步便可初步分離開。*法是目前提取不降解的RNAzui有效的方法,其應(yīng)用舉例如下:
肝臟rRNA的提取:按肝重(鮮)加入10倍容積*-甲酚混合液(500g*及70ml n-甲酚于50ml蒸餾水中,另加入0.5g 8-羥基喹啉配成)及10倍容積的0.5%萘-1,5-二磺酸水溶液(g/V)做勻漿后在20℃攪拌20min。
肝臟細胞核內(nèi)mRNA的提?。合确蛛x細胞核,再將核懸浮于3倍容積的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液(g/V)中勻漿后加入等量90%(g/V)*水溶液(內(nèi)含0.1%8-羥基喹啉)在2℃振蕩提取30min。
酵母tRNA的提?。?00g酵母(濕重)加入200ml水,300ml 90%*水溶液,振蕩2h,4℃冰箱中過液,使之提取*。
以上介紹了用冷酚法提取各種RNA的一些實例,近來還有皂土酚法(即除*外還加入皂土吸附蛋白質(zhì))提取RNA,據(jù)報道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但應(yīng)用*法提取核酸時,須注意市售*常含有少量重金屬和雜質(zhì),可能導(dǎo)致核酸降解,使用時,一般需要減壓重蒸。
?。?)DNA的提?。篋NA主要存在于細胞核中,天然狀態(tài)的DNA絕大多數(shù)是以脫氧核糖核蛋白形式存在。人細胞中提取DNA時,一般先獲得脫氧核糖核蛋白,再將蛋白質(zhì)除去,從中分離DNA。常用的方法是以1mol/L氯化鈉溶液抽提,得到的脫氧核糖核蛋白溶液與含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振蕩,除去蛋白質(zhì)?;蛘咴诮M織細胞破碎后以低濃度0.14mol/L氯化鈉溶液(也可用0.1mol/L氯化鈉加0.05mol/L檸檬酸代替)反復(fù)洗滌除去核糖核蛋白,再以1mol/L氯化鈉提取脫氧核糖核蛋白,提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白質(zhì)。兩種方法比較,后一種方法使核酸降解可能少一些。以稀鹽溶液提取DNA時,加入適量去污劑更有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。
應(yīng)用*法也可以提取DNA而且不用經(jīng)過脫氧核糖核蛋白這一步驟,例如大鼠肝勻漿在6%*鹽溶液內(nèi),加入同體積90%*水溶液,室溫下提取1h,再經(jīng)進一步提純可獲得98%~99%純度的DNA。*法也是目前提取DNAzui常用的方法之一。
?。?)活性多肽及遞質(zhì)的提取
大體上與蛋白質(zhì)的提取方法相似,可參照進行。經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)如*、腎上腺素、乙酰*、5-羥色胺等均可化學(xué)合成,無需用很多精力去提取。
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