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單克隆抗體細(xì)胞的選擇

2011年06月27日 08:48:06人氣:602來源:上海滬宇生物科技有限公司

(一)脾細(xì)胞
1.材料
(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。
(2) 1640培養(yǎng)液
(3) 2.5%FCS-1640營(yíng)養(yǎng)液
2.操作方法
(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠。
(2) 將小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在無菌條件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。
(4) 用鑷子輕輕擠壓脾,做成脾細(xì)胞懸液,用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。
(5) 直立小試管3min,使大塊的結(jié)締組織下沉,把細(xì)胞懸液移入離心管中。
(6) 以2.5%FCS—1640充滿離心管,并以400g離心7min~10min(與此同時(shí)應(yīng)開始制備骨髓細(xì)胞)。
(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。
(8) 重復(fù)⑹、⑺步驟。
(9) 計(jì)算細(xì)胞,以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查,活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80%為合格。

(二)骨髓瘤細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白,這樣的瘤細(xì)胞融合后,可能影響或降低所分泌抗體的滴度,所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。
選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件:①該瘤細(xì)胞系的來源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系,以便兩者的組織相容性抗原一致;②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài),不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外;③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,106個(gè)細(xì)胞/ml;④生長(zhǎng)速度快,繁殖時(shí)間短。
目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(簡(jiǎn)稱SP2);③P2—X? ­—Ag8·6·5·3(簡(jiǎn)稱653);④FO
以653zui為常用,它是由礦物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)誘發(fā)出來的一種漿細(xì)胞瘤(Minerol Oil plasmacy toma,MOPC)并經(jīng)過培育形成一株8-氮*有抵抗力的亞系。
骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。
由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài),很容易脫落,因此不需要*處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象,在融合前,可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8-氮*。取約1×107~6×107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(即培養(yǎng)15h~20h)的骨髓瘤細(xì)胞,在室溫離心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再懸浮并計(jì)數(shù)。

(三)飼養(yǎng)細(xì)胞

在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中,單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖,必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖,加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder cell)。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過程中,就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體,因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞,如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等,常選用腹腔滲出細(xì)胞,其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是:一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞,另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片,為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。

1.材料
(1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。
(2)11.6%蔗糖溶液(經(jīng)10磅30min高壓滅菌)。

2.操作方法
(1)拉頸處死小鼠。
(2)70%酒精浸泡消毒10min。
(3)用*將小鼠腹部剪開一小口,剝開皮膚,露出腹腔。
(4)用注射器將4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體,加入離心管。
(5)1 000r/min離心10min。
(6)取上清,以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞,使每毫升含40萬個(gè)活細(xì)胞。
(7)以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿,每孔0.05ml,含2萬個(gè)細(xì)胞,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少,則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。()

原文地址:/biotech/Immunity/2008/b814495062_4.html

關(guān)鍵詞:顯微鏡 培養(yǎng)箱
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