染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)指南及技術(shù)總結(jié)
       

      ChIP是一項(xiàng)比較流行的研究轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF）與啟動(dòng)子（promoter）相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于ChIP采用甲醛固定活細(xì)胞或者組織的方法，所以能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況。當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時(shí)，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。
染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChiP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。它能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法。CHIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，CHIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。
一般ChIP的流程是：甲醛處理細(xì)胞---收集細(xì)胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合---加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀---對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物---解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。
       在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實(shí)就是用ChIP的方法研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合，具體方法和ChIP差不多，只是實(shí)驗(yàn)過程中要注意防止RNase，zui后分析的時(shí)候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實(shí)就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來準(zhǔn)備樣品）。
*天：
（一）、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。
1、取出1平皿細(xì)胞（10cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的終濃度為1％（培養(yǎng)基共有9ml）。
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯(lián)：加*至終濃度為0.125M。450 ul 2.5M*于平皿中?；靹蚝螅谑覝叵路胖?min即可。
4、吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。
5、細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預(yù)冷后2000rpm 5min收集細(xì)胞。
6、倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×106個(gè)細(xì)胞。這樣每100ul溶液含1×106個(gè)細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長(zhǎng)滿板為5×106個(gè)細(xì)胞。本次細(xì)胞長(zhǎng)得約為80％。即為4×106個(gè)細(xì)胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800ul。
7、超聲破碎：VCX750，25％功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。
（二）、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結(jié)束后，10，000g 4oC離心10min。去除不溶物質(zhì)。
留取300ul做實(shí)驗(yàn)，其余保存于-80oC。
300ul中，100ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100ul不加抗體做為對(duì)照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65oC處理3h解交聯(lián)，跑電泳，檢測(cè)超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC顛轉(zhuǎn)混勻1h。
10、1h后，在4oC靜置10min沉淀，700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體，另一管中則不加抗體。4oC顛轉(zhuǎn)過夜。
（三）、檢驗(yàn)超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4ul5MNaCl，65oC處理2h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測(cè)超聲效果。
第二天：
（一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗。
12、孵育過夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC顛轉(zhuǎn)2h。
13、4oC靜置10min后，700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4oC顛轉(zhuǎn)10min，4oC靜置10min沉淀，700rpm離心1min，除去上清。
洗滌溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.LiCl wash buffer-one wash
d.TE buffer-two wash
15、清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul10％SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。zui終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯(lián)：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。
混勻，65oC解交聯(lián)過夜。
第三天：
（一）、DNA樣品的回收
17、解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37oC孵育1h。
18、每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10mg/ml蛋白酶K。
45oC處理2h。
19、DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。zui終的樣品溶于100ulddH2O。
（二）、PCR分析