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免疫組化試驗(yàn)步驟

2011年05月24日 09:40:40人氣:1537來源:上海莼試生物技術(shù)有限公司

(一)、儀器設(shè)備
1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐;
2)水浴鍋
(二)、試劑
1)PBS緩沖液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g。
3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
5)酶消化液: a、0.1%*液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%*液:用0.1N的HCl配制。
6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7)封裱劑:
a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0~9.5)等量混合;
b、油和TBS(或PBS)配制。
8)TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標(biāo)本;pH7.0~7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。
(三)、操作流程
1、脫蠟和水化
脫蠟前,應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
1)組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后再浸泡10分鐘;
2)無水乙醇中浸泡5分鐘;
3)95%乙醇中浸泡5分鐘;
4)70%乙醇中浸泡5分鐘;
2、抗原修復(fù)
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。
1)抗原熱修復(fù)
(1)高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M*緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子,但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后,去除熱源,置入涼水中,當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。
(2)煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M*緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10~15分鐘。
(3)微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M*緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5~10分鐘,反復(fù)1-2次。適用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法 常用0.1%*和0.4%*液。*使用前預(yù)熱至37℃,切片也預(yù)熱至37℃,消化時(shí)間約為5~30分鐘;*消化37℃時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。
3、免疫組織化學(xué)染色
SP法
1)脫蠟、水化;
2)PBS洗2~3次各5分鐘;
3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室溫靜置10分鐘;
4)PBS洗2~3次各5分鐘;
5)抗原修復(fù);
6)PBS洗2~3次各5分鐘;
7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8)滴加Ⅰ抗50μl,室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)。
9)4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。
10)PBS洗3次各5分鐘;
11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置,或37℃1小時(shí);
12)II抗中可加入0.05%的tween-20。
13)PBS洗3次各5分鐘;
14)DAB顯色5~10分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度;
15)PBS或自來水沖洗10分鐘;
16)蘇木精復(fù)染2分鐘,鹽酸酒精分化;
17)自來水沖洗10~15分鐘;
18)脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1)脫蠟、水化。
2)PBS洗兩次各5分鐘。
3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,蒸餾水洗3次。
4)抗原修復(fù)。
5)PBS洗5分鐘。
6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)(4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘)。
8)PBS洗三次每次2分鐘。
9)滴加*化二抗,20℃~37℃20分鐘。
10)PBC洗3次每次2分鐘。
11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘。
12)PBS洗4次每次5分鐘。
13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
14)蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。
15)脫水、透明、封片、鏡檢。

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