1. 流動相的在線混合

所有的流動相在線混合都是從方便出發(fā)的結(jié)果，流動相混合的不充分是基線噪音的一個重要來源，混合方式主要兩種：

a. 低壓混合：采取時間脈沖的方式，利用比例閥，將不同流動相按一定比例混合。

b. 高壓混合：利用多個泵頭，控制每個泵的流量，來將流動相按一定比例混合。

在流動相混合后，一般都有一個混合器(Mixer)，來幫助混合的更加充分。從流動相開始混合在一起，到流動相到達色譜柱頭，這一段體積叫做延遲體積(Delay Volume)。 Mixer體積越大，混合越好，但是相應(yīng)延遲體積就越大，造成梯度的延遲。換句話說，就是流動相的變化，需要一定時間后，才能真正到達色譜柱，對分離產(chǎn)生影響。

a. 這個現(xiàn)象在使用UPLC或者UHPLC的時候，會有比較明顯的作用。

b. 為什么相同梯度方法，在不同儀器，或者不同品牌的儀器之間轉(zhuǎn)化時，保留時間可能不一樣？ 其主要原因就是延遲體積的不同。

在線混合很難做到非常均一的混合效果，這個在示差檢測器（RID）上的效果zui明顯。這也是為什么示差檢測器都要求將流動相預(yù)混到一個瓶子里，不能走梯度的原因。

那如何減小因為混合而造成的基線噪音呢？

a. 對于等度的方法，非常簡單，預(yù)混流動相就可以了。

b. 對于梯度的方法，部分預(yù)混流動相也會幫助更好的混合，怎么做呢？看下面的例子。
方法要求乙腈/水比例從10%走到85%。 那可以將流動相A配成10%的乙腈，流動相B配成85%的乙腈，然后A/B梯度從0%走到100%。這就是部分預(yù)混。

c. 增大Mixer的體積。一般mixer的體積從幾百ul到幾個ml都有，在允許的延遲時間下，更換一個體積更大的Mixer，能夠有效提高混合的效率。每個se生產(chǎn)廠家的Mixer體積都不一樣，基本都可以混用。有碰到過一個Agilent的1100基線噪音大，后來換成1050的mixer就好了，因為1050的mixer比較大一些。

2．液相硬件問題造成的基線噪音

如果液相系統(tǒng)某些地方的工作不正常，也可能造成基線的噪音。

a. 系統(tǒng)有漏。特別是肉眼無法發(fā)現(xiàn)的微漏或者泵的內(nèi)漏，會造成流速的變化和混合比例的變化，從而導(dǎo)致基線噪音。檢查的方法就是對系統(tǒng)進行壓力測試：將系統(tǒng)從某個地方用死堵堵上，如泵出口，或者自動進樣器出口，將壓力升高到350bar后停泵，監(jiān)測壓力下降的情況。一般的標(biāo)準(zhǔn)是2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。

b. 梯度比例問題?？梢詫ο到y(tǒng)進行一個梯度測試，來檢查梯度混合是否準(zhǔn)確和一致。將A配成0.1%的丙酮，B是水。在265nm的波長下，將A的比例10%，20%，30%這樣一個一個的升高，每個比例走3min?？梢愿鶕?jù)計算，看每個基線臺階上升是否準(zhǔn)確。 也可以從0-100%走一個連續(xù)的梯度，看基線上升的平滑性和線性。

3．流動相脫氣不好造成的基線噪音

對流動相進行脫氣，不僅僅是為了防止系統(tǒng)里面氣泡的產(chǎn)生。 流動相脫氣越好，基線就會越好。如今zui常用的脫氣方式是在線脫氣機，但是有的時候脫氣并不*。所以當(dāng)有基線噪音問題是，可以考慮采取多種的脫氣方式。

4．系統(tǒng)潔凈程度

前面1-3點講的都是內(nèi)在原因，造成的基線噪音或者波動。如果你前面的原因都找過了，問題還沒有解決，就得考慮一下是不是流動相里面是否有雜質(zhì)了。如何檢查判斷是否為流動相的問題呢？

a. 每次更換一種流動相，看基線結(jié)果。

b. 重新配置所有流動相。這種方式比較快，但可能無法找到根本原因。

要特別注意在流動相的配置過程中，是否引入了污染，比如使用了不干凈的玻璃器皿什么的。更換溶劑的品牌和批次也是方法之一。

色譜柱長期使用造成的污染有時候也會造成基線波動。有些時候樣品里面可能有些保留非常強的組分，可能在色譜柱上很長時間才慢慢被沖出來，這時候已經(jīng)不是一個峰了，而是基線的干擾或者波動了。

避免這種問題的方法：在每批樣品后，用甲醇或者已經(jīng)長時間沖洗色譜柱。另外，專柱也是一個好的習(xí)慣。如果一根se譜柱上作很多不同的樣品，也可能導(dǎo)致互相之間的污染和影響。

5．電路的噪音

對于UV檢測器來說，就是采樣頻率不合適而產(chǎn)生的噪音?，F(xiàn)在隨著超液相的普及，檢測器的采樣頻率也越來越高，有的可以達到80Hz以上。但是如果一味追求高采樣頻率，可能對靈敏度沒有任何幫助，反倒產(chǎn)生比較大的噪音。(我們后面可能會有一起專門檢測器的時候，會更詳細(xì)的討論這個的原因)

一般來說，我們需要保證一個se譜峰上面有15-20個點，來保證比較平滑的峰形和比較準(zhǔn)確的定量結(jié)果。如果我的一個峰的時間寬度是0.5min，就是是30s，那只要保證1Hz的采樣頻率就足夠了。如果在UPLC上面，一個峰的時間寬度是0.05min，也就是3s，就需要10Hz以上的采樣頻率。 那80Hz的采樣頻率什么時候用呢？ 你的一個峰只有0.5s的時候。

理論上的計算是這樣的
N=16（T/W）^2
N是柱效，T是保留時間，W是峰寬。

一般se譜如果柱效12000的塔板數(shù)。在5min的時候，出峰寬度大概計算出來時11s。你可以根據(jù)計算結(jié)果來調(diào)整檢測器的合適的采樣頻率。

上面從理論到實踐，從各個方面分析的液相色譜基線噪音或者波動的來源，以及相應(yīng)排除問題的方法，希望大家也能夠分享自己的經(jīng)驗。

1. 流動相的在線混合
所有的流動相在線混合都是從方便出發(fā)的結(jié)果，流動相混合的不充分是基線噪音的一個重要來源，混合方式主要兩種：

a. 低壓混合：采取時間脈沖的方式，利用比例閥，將不同流動相按一定比例混合。

b. 高壓混合：利用多個泵頭，控制每個泵的流量，來將流動相按一定比例混合。

在流動相混合后，一般都有一個混合器(Mixer)，來幫助混合的更加充分。從流動相開始混合在一起，到流動相到達色譜柱頭，這一段體積叫做延遲體積(Delay Volume)。 Mixer體積越大，混合越好，但是相應(yīng)延遲體積就越大，造成梯度的延遲。換句話說，就是流動相的變化，需要一定時間后，才能真正到達色譜柱，對分離產(chǎn)生影響。

a. 這個現(xiàn)象在使用UPLC或者UHPLC的時候，會有比較明顯的作用。

b. 為什么相同梯度方法，在不同儀器，或者不同品牌的儀器之間轉(zhuǎn)化時，保留時間可能不一樣？ 其主要原因就是延遲體積的不同。

在線混合很難做到非常均一的混合效果，這個在示差檢測器（RID）上的效果zui明顯。這也是為什么示差檢測器都要求將流動相預(yù)混到一個瓶子里，不能走梯度的原因。

那如何減小因為混合而造成的基線噪音呢？

a. 對于等度的方法，非常簡單，預(yù)混流動相就可以了。

b. 對于梯度的方法，部分預(yù)混流動相也會幫助更好的混合，怎么做呢？看下面的例子。
方法要求乙腈/水比例從10%走到85%。 那可以將流動相A配成10%的乙腈，流動相B配成85%的乙腈，然后A/B梯度從0%走到100%。這就是部分預(yù)混。

c. 增大Mixer的體積。一般mixer的體積從幾百ul到幾個ml都有，在允許的延遲時間下，更換一個體積更大的Mixer，能夠有效提高混合的效率。每個色生產(chǎn)廠家的Mixer體積都不一樣，基本都可以混用。有碰到過一個Agilent的1100基線噪音大，后來換成1050的mixer就好了，因為1050的mixer比較大一些。
2．液相硬件問題造成的基線噪音
如果液相系統(tǒng)某些地方的工作不正常，也可能造成基線的噪音。

a. 系統(tǒng)有漏。特別是肉眼無法發(fā)現(xiàn)的微漏或者泵的內(nèi)漏，會造成流速的變化和混合比例的變化，從而導(dǎo)致基線噪音。檢查的方法就是對系統(tǒng)進行壓力測試：將系統(tǒng)從某個地方用死堵堵上，如泵出口，或者自動進樣器出口，將壓力升高到350bar后停泵，監(jiān)測壓力下降的情況。一般的標(biāo)準(zhǔn)是2-3bar/min的下降是正常水平?；蛘?5%/10min的下降。

b. 梯度比例問題?？梢詫ο到y(tǒng)進行一個梯度測試，來檢查梯度混合是否準(zhǔn)確和一致。將A配成0.1%的丙酮，B是水。在265nm的波長下，將A的比例10%，20%，30%這樣一個一個的升高，每個比例走3min?？梢愿鶕?jù)計算，看每個基線臺階上升是否準(zhǔn)確。 也可以從0-100%走一個連續(xù)的梯度，看基線上升的平滑性和線性。
3．流動相脫氣不好造成的基線噪音
對流動相進行脫氣，不僅僅是為了防止系統(tǒng)里面氣泡的產(chǎn)生。 流動相脫氣越好，基線就會越好。如今zui常用的脫氣方式是在線脫氣機，但是有的時候脫氣并不*。所以當(dāng)有基線噪音問題是，可以考慮采取多種的脫氣方式。
4．系統(tǒng)潔凈程度
前面1-3點講的都是內(nèi)在原因，造成的基線噪音或者波動。如果你前面的原因都找過了，問題還沒有解決，就得考慮一下是不是流動相里面是否有雜質(zhì)了。如何檢查判斷是否為流動相的問題呢？

a. 每次更換一種流動相，看基線結(jié)果。

b. 重新配置所有流動相。這種方式比較快，但可能無法找到根本原因。

要特別注意在流動相的配置過程中，是否引入了污染，比如使用了不干凈的玻璃器皿什么的。更換溶劑的品牌和批次也是方法之一。

色譜柱長期使用造成的污染有時候也會造成基線波動。有些時候樣品里面可能有些保留非常強的組分，可能在色譜柱上很長時間才慢慢被沖出來，這時候已經(jīng)不是一個峰了，而是基線的干擾或者波動了。

避免這種問題的方法：在每批樣品后，用甲醇或者已經(jīng)長時間沖洗色譜柱。另外，專柱也是一個好的習(xí)慣。如果一根色譜柱上作很多不同的樣品，也可能導(dǎo)致互相之間的污染和影響。
5．電路的噪音
對于UV檢測器來說，就是采樣頻率不合適而產(chǎn)生的噪音?，F(xiàn)在隨著超液相的普及，檢測器的采樣頻率也越來越高，有的可以達到80Hz以上。但是如果一味追求高采樣頻率，可能對靈敏度沒有任何幫助，反倒產(chǎn)生比較大的噪音。(我們后面可能會有一起專門檢測器的時候，會更詳細(xì)的討論這個的原因)

一般來說，我們需要保證一個se譜峰上面有15-20個點，來保證比較平滑的峰形和比較準(zhǔn)確的定量結(jié)果。如果我的一個峰的時間寬度是0.5min，就是是30s，那只要保證1Hz的采樣頻率就足夠了。如果在UPLC上面，一個峰的時間寬度是0.05min，也就是3s，就需要10Hz以上的采樣頻率。 那80Hz的采樣頻率什么時候用呢？ 你的一個峰只有0.5s的時候。

理論上的計算是這樣的
N=16（T/W）^2
N是柱效，T是保留時間，W是峰寬。

一般色譜如果柱效12000的塔板數(shù)。在5min的時候，出峰寬度大概計算出來時11s。你可以根據(jù)計算結(jié)果來調(diào)整檢測器的合適的采樣頻率。

上面從理論到實踐，從各個方面分析的液相色譜基線噪音或者波動的來源，以及相應(yīng)排除問題的方法，希望大家也能夠分享自己的經(jīng)驗。