1．準(zhǔn)備工作
應(yīng)用抗體柱對(duì)各種蛋白質(zhì)進(jìn)行親和純化的zui主要特點(diǎn)是在足夠溫和的條件廠就能將抗原從柱上洗脫下來，并能保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和／或功能不改變。連接抗原和抗體的結(jié)合鍵的類型和數(shù)量是決定洗脫難易的關(guān)鍵。在制備大規(guī)模層析柱用于純化之前，有必要對(duì)所有可利用的抗體進(jìn)行測試，并從中選擇適當(dāng)?shù)目贵w制備親和層析柱。
建議不應(yīng)將抗體流經(jīng)含有微珠的層析柱，因?yàn)檫@樣會(huì)使抗體形成·個(gè)濃度梯度，從析柱1：而的濃度高，而下面的濃度低。為避免這種情況，應(yīng)將抗體與微珠混合成泥漿狀而使其結(jié)合。
2．所需的溶液、試劑和特殊設(shè)備
抗體；蛋白A或蛋白G微珠；0．2mol／ml硼酸鈉（pH9．0）；二甲基庚二酸（DMP）；PBS；0．2mol／L乙醇胺（pH8．0）；考馬斯亮藍(lán)；Laemmli樣品緩沖液；搖床。
3。操作步驟
（1）將抗體與蛋白A或蛋白G微珠結(jié)合，一般使用的層析柱，每毫升濕的微珠大約可結(jié)合2mg的抗體。將抗體與蛋白A／G微珠混合，使其成為一種稀薄的漿狀。在10ml溶液總量中大約含lml微珠。輕輕振蕩混勻，室溫孵育1h。
如前所述，免疫親和層析柱一般用單抗或經(jīng)過親和純化的多抗制備?？梢杂貌煌瑏碓吹目贵w，包括雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹水或純化的抗體溶液， 由于與蛋白A／G微珠結(jié)合，可作為去除貯存緩沖液或交換緩沖液中其他物質(zhì)的步驟。
如果需知道與微珠結(jié)合抗體的準(zhǔn)確濃度，在與微珠結(jié)合之前應(yīng)對(duì)抗體進(jìn)行純化。
（2）用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉緩沖液（pH9．0）洗滌微珠2次，以3000g離心5min，或10 000g離心30s。
（3）用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉（pH9．0）重懸微珠，并取出相當(dāng)于10u1微珠的混懸液。加足量的DMP（固體）至終濃度為20retool／L。
如用DMP交聯(lián)，應(yīng)為pH 8．3以上。
（4）輕輕混勻，室溫孵育30min，取出相當(dāng)于10txl已偶聯(lián)的微珠。
（5）用0．2mol／L乙醇胺洗滌微珠1次，以終止反應(yīng)。然后用0．2mol／L懸微珠，室溫孵育2h，輕輕混勻。
（6）再次洗滌后，用含0．01％硫柳汞的PBS重懸微珠。
（7）檢測微珠樣品與抗體結(jié)合前后的結(jié)合效率，將樣品分別加入Laemmli樣品緩沖液中煮沸。分別取出相當(dāng)于1／Il和9btl的兩種樣品，在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)合前樣品呈現(xiàn)重鏈區(qū)帶（分子質(zhì)量為55kDa）而結(jié)合后樣品則無，表明交連成功
親和層析柱在含硫柳汞緩沖液中置4C可保存1年以上。制備好的微珠即可用于抗原的免疫親和純化。
 

凝膠結(jié)合效率