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人真胰島素(TI)ELISA測定試劑盒

2009年12月29日 16:23:11人氣:653來源:廈門慧嘉生物科技有限公司

人真胰島素(TI)ELISA測定試劑盒

本試劑盒僅供體外研究使用                                    

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中TI含量。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗TI抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的抗TI抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TI呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板:一塊(96孔)

2.         標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,其濃度為200 pmol/L,做系列倍比稀釋注:不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋后,分別稀釋成200 pmol/L,100 pmol/L,50 pmol/L25 pmol/L,12.5 pmol/L,6.25 pmol/L,3.12 pmol/L,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pmol/L,臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制100 pmol/L標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 200 pmol/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(100ul/孔),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A990ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液1×30ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

11.     覆膜1×5

 

標(biāo)本的采集及保存

1.         血清:全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.         血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.         細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請(qǐng)1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注:以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,-20℃不應(yīng)超過1個(gè)月,-80℃不應(yīng)超過2個(gè)月;標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測;高血脂的標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理,可直接檢測。

 

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,請(qǐng)?zhí)崆芭渲坪盟性噭?;試劑或樣品稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),均應(yīng)用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實(shí)驗(yàn)室在操作前*行預(yù)實(shí)驗(yàn)以建立*稀釋倍數(shù)。

1.         加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37反應(yīng)120分鐘。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.         棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時(shí)內(nèi)配制),酶標(biāo)板加上覆膜, 37反應(yīng)60分鐘。

3.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。

4.         每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,酶標(biāo)板加上覆膜37反應(yīng)60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,酶標(biāo)板加上覆膜37避光顯色30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測。

1.         每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔),該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

2.         嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。

3.         洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,避免酶標(biāo)板長時(shí)間處于干燥狀態(tài)。

4.         消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

5.         在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

6.         未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,請(qǐng)配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時(shí),一次不要小于10ul),以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差;檢測液A、B,以及底物溶液在使用前,應(yīng)置于37℃溫育30分鐘;請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

7.         建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層

紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需

要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人TI,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,如curve expert 1.3),根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1.         洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。

2.         一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。

3.         請(qǐng)每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。

4.         如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請(qǐng)先稀釋后再測定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.         在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí),請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。

6.         底物請(qǐng)避光保存。

檢測范圍:3.12 pmol/L - 200 pmol/L

zui低檢測限0.78 pmol/L

說明

1.          在儲(chǔ)存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

2.          小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時(shí),*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且,洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。

3.          試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。

4.          濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

5.          剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

6.          所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

7.          有效期:6個(gè)月

 

廈門慧嘉生物科技有限公司專業(yè)代理眾多生命科學(xué)領(lǐng)域的。致力于各種ELISA試劑盒、免疫組化試劑盒、一抗二抗、細(xì)胞因子、生物試劑、移液器、耗材的銷售推廣及服務(wù)工作。
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