人8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)液體中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量。

概述

DNA鏈上的堿基*C-8位易受到羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊而發(fā)生羥化，生成加合物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）。8-OHdG是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物，是*的內(nèi)源性及外源性因素對DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物。8-OHdG是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物之一。在復(fù)制過程中，DNA鏈上8-OHdG可以與C以外的其它堿基配對形成點突變，其中GC→TA突變的發(fā)生已為大量研究所證實，并被認為是氧化應(yīng)激因素致癌、致突變的主要機理之一。機體修復(fù)機制正常時，8-OHdG可以在hOGG1等酶的作用下從DNA鏈上切除并重新?lián)饺胝５?堿基，而切下的8-OHdG則可入血經(jīng)尿液排出體外。8-OHdG在體內(nèi)穩(wěn)定存在，一旦形成不再被機體進一步代謝，尿中8-OHdG含量與細胞內(nèi)DNA氧化損傷程度相關(guān)。目前機體8-OHdG水平已被廣泛接受為評價DNA氧化損傷的標(biāo)志物，并用來估計氧化應(yīng)激相關(guān)癌癥發(fā)生的危險性。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中8-OHdG水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入8-OHdG抗原、*化的抗人8-OHdG抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的8-OHdG呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為20,000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋10,000 pg/ml，5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312.5 pg/ml，156 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制10,000 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 20,000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1.  細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.  血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2.         為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

3.         未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

4.         建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需

要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人8-OHdG，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1.         洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2.         一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3.         請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4.         如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.         在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6.         底物請避光保存。

檢測范圍：

156 pg/ml - 10,000 pg/ml

說明

1.         試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時，僅適用于部分試劑）；2-8℃（頻繁使用時）。

2.         有效期：6個月

3.         濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

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