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酶底物法與多管發(fā)酵法和紙片法測(cè)定水中糞大腸菌群方法比較

2022年08月31日 13:53:05人氣:4584來(lái)源:河南綏凈環(huán)??萍加邢薰?/span>

  糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分,又稱耐熱大腸菌群。生長(zhǎng)于人與部分動(dòng)物體內(nèi)腸道中,水體中的糞大腸菌群主要來(lái)自糞便污染,因此通過(guò)測(cè)定水中糞大腸菌群的含量,可間接得出水體受糞便污染的情況,在環(huán)境監(jiān)測(cè)和衛(wèi)生防疫方面具有重要意義
 
  本文對(duì)比三種不同糞大腸菌群的檢測(cè)方法,通過(guò)比較多管發(fā)酵法、紙片快速法和酶底物法的檢測(cè)結(jié)果,討論酶底物法檢測(cè)糞大腸菌群的可行性及應(yīng)用。
 
  一、檢測(cè)方法及原理
 
  1、多管發(fā)酵法
 
  將水樣接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中,在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行初發(fā)酵試驗(yàn),大腸菌群生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,產(chǎn)酸使乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中的p H降低,發(fā)酵管由紫色變黃色;產(chǎn)氣使發(fā)酵管中導(dǎo)管產(chǎn)生小氣泡,產(chǎn)酸或產(chǎn)氣則為陽(yáng)性,否則為陰性。
 
  將顯陽(yáng)性的發(fā)酵管接種至EC培養(yǎng)液,在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行復(fù)發(fā)酵,造成不利于自然環(huán)境中的大腸桿菌生長(zhǎng)的條件,而糞大腸菌群將會(huì)在44.5℃下繼續(xù)存活生長(zhǎng)繁殖,由此通過(guò)復(fù)發(fā)酵管中產(chǎn)氣情況判定陽(yáng)性。
 
  通過(guò)復(fù)發(fā)酵后顯陽(yáng)性的發(fā)酵管數(shù),查詢MPN表,通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出糞大腸菌群濃度。
 
  2、紙片快速法
 
  通過(guò)將水樣接種于吸附了溴甲酚紫和2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑 (TTC) 以及乳糖等營(yíng)養(yǎng)成分的無(wú)菌濾紙上,在44.5±0.5℃下培養(yǎng)18~24 h,當(dāng)糞大腸菌繁殖產(chǎn)酸使溴甲酚紫變黃色,產(chǎn)氣使相應(yīng)的脫氫酶催化底物TTC形成紅色的不溶性三苯甲臢 (TTF) ,在黃色背景顯示出紅色的斑點(diǎn)或紅暈,判定糞大腸菌群存在,該接種紙片顯陽(yáng)性,通過(guò)查詢MPN表計(jì)算出相應(yīng)濃度值。
 
  3、酶底物法
 
  將已加入培養(yǎng)基的水樣混勻與97孔定量盤(pán),置于44.5±0.5℃培養(yǎng)24h,糞大腸菌能在該溫度產(chǎn)生β-半乳糖苷酶 (β-D-galactosidase) ,分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖 (ONPG) 生成黃色的鄰硝基beng酚,通過(guò)定量盤(pán)大小孔顯黃色數(shù)查詢酶底物法的MPN表,計(jì)算出糞大腸菌群的濃度。
 
  二、實(shí)驗(yàn)步驟
 
  根據(jù)水樣污染程度選擇不同的稀釋倍數(shù),將水樣接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵管中,在37±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行初發(fā)酵試驗(yàn),產(chǎn)酸產(chǎn)氣顯陽(yáng)性;將顯陽(yáng)性的發(fā)酵管用3 mm接種環(huán)接種至EC培養(yǎng)液,在44.5±0.5℃下培養(yǎng)24±2 h進(jìn)行復(fù)發(fā)酵,發(fā)酵管內(nèi)小導(dǎo)管有氣泡則顯陽(yáng)性,記錄陽(yáng)性管數(shù),查對(duì)應(yīng)MPN表,計(jì)算結(jié)果。
 
  1、紙片快速法
 
  根據(jù)水樣污染程度,樣品按照三個(gè)10倍遞減的不同接種量接種,每個(gè)接種量分別接種5張紙片,共接種15張紙片。接種水樣應(yīng)均勻滴加在紙片上,紙片充分浸潤(rùn)、吸收水樣,用手在聚丙烯塑膜袋外側(cè)輕輕撫平,做好標(biāo)記。接種后立即放置44.5±0.5℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h后,通過(guò)紙片上顏色變化判定陽(yáng)性紙片數(shù),查詢對(duì)應(yīng)MPN表,計(jì)算結(jié)果。
 
  2、酶底物法
 
  根據(jù)水樣受污染程度,進(jìn)行樣品稀釋?zhuān)瑢⑸唐坊傅孜锱囵B(yǎng)基加入100 ml待測(cè)樣品中,充分混勻,*溶解后全部倒入97孔定量盤(pán)中,撫平定量盤(pán)背面,趕出氣泡,用程控定量封口機(jī)封口。放置于44.5±0.5℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤(pán)對(duì)比,根據(jù)陽(yáng)性孔數(shù)查詢對(duì)應(yīng)的MPN表,計(jì)算結(jié)果。
 
  三、結(jié)果與討論
 
  1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析
 
  實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)使用的玻璃器皿按要求進(jìn)行滅菌操作,制備無(wú)菌水時(shí)檢驗(yàn)純水質(zhì)量并進(jìn)行滅菌操作,并開(kāi)啟實(shí)驗(yàn)室紫外燈對(duì)細(xì)菌室滅菌2 h以上。
 
  根據(jù)方法標(biāo)準(zhǔn)和《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法 (第四版) 》要求,分別用滅菌水對(duì)每批次樣品培養(yǎng)基 (培養(yǎng)紙片) 進(jìn)行全程序空白和實(shí)驗(yàn)室空白檢驗(yàn),均未檢出,亦無(wú)任何顏色或氣泡等明顯變化。
 
  每次實(shí)驗(yàn)均用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌做陽(yáng)性、陰性對(duì)照,且大腸埃希氏菌對(duì)照組樣品均顯陽(yáng)性,產(chǎn)氣腸桿菌對(duì)照組均顯陰性。



 
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