限制性內(nèi)切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點(diǎn)兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護(hù)堿基。

添加保護(hù)堿基的目的

    在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，有時我們會在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個至幾個保護(hù)堿基，才能使所定的限制酶對其識別位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。因此在設(shè)計(jì)PCR引物時，為保護(hù)5` 端外加的內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，人為地在酶切位點(diǎn)序列的5‘端外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護(hù)堿基，用來提高酶切時的活性，使酶切*。

其次，在分子克隆實(shí)驗(yàn)中選擇載體的酶切位點(diǎn)時，相臨的兩個酶切位點(diǎn)往往不能同時使用，因?yàn)橐粋€位點(diǎn)切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。

添加保護(hù)堿基的原則

    添加保護(hù)堿基，需要考慮兩個因素：一是堿基數(shù)目，一是堿基種類。

    添加保護(hù)堿基時，zui關(guān)心的應(yīng)該是保護(hù)堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點(diǎn)，添加幾個保護(hù)堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。

    一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以正常進(jìn)行;而有一類，僅僅只加入兩個保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進(jìn)行，這是因?yàn)閮?nèi)切酶不能正常結(jié)合DNA段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護(hù)堿基，常用的HindIII也要三個。

   添加什么保護(hù)堿基，如果嚴(yán)格點(diǎn)，是根據(jù)兩條引物的Tm值和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小，GC%較低，添加時多加G或C，反之亦反。

    為了解不同內(nèi)切酶對識別位點(diǎn)以外zui少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位點(diǎn)很接近時），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點(diǎn)兩端至少加上6個保護(hù)堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。

   當(dāng)在引物5’端添加酶切位點(diǎn)時要考慮：

   1）該目的序列內(nèi)部不得含有相同的酶切位點(diǎn)，這樣的錯誤會給將來的克隆造成麻煩。

   2）如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點(diǎn)的外側(cè)再加上保護(hù)堿基，不同的酶對于保護(hù)堿基的要求是不同的。

   如果不設(shè)計(jì)保護(hù)堿基，則多半要用TA 克隆的方式連接到質(zhì)粒上，這時要注意Taq 酶的選擇，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位點(diǎn)和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。

    當(dāng)計(jì)算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。