1. 器材：

   剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭眼科*子（游離血管用）一把、直頭眼科*（剪血管用）一把，*架，*片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑18cm）、彎頭*四把，直頭*兩把，手術(shù)縫合線(xiàn)，塑料放血管，紗布等。

2. 試劑：

   生理鹽水（或PBS），

   弗氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant, FCA） Sigma F-5881，

   弗氏不*佐劑（Freund’s incomplete adjuvant, FIA） Sigma F-5506，

   二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2% NaN3

3. 兔子的選擇：

    兔子的重量應(yīng)在四斤以上，兩耳光滑，明顯可見(jiàn)耳靜、動(dòng)脈，健康。

4. Pre-bleeding：

    抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測(cè)抗體時(shí)作為陰性對(duì)照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時(shí)間，可以進(jìn)行耳動(dòng)脈取血。取血量約5ml足矣。

    免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量?？乖?jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過(guò)程比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，但若乳化不充分，會(huì)影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。免疫用FCA，以后都用FIA。

   免疫方法可采用背部多點(diǎn)注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)注射（不要選擇臨近位點(diǎn)，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。

   免疫一周后，可以耳動(dòng)脈取血檢測(cè)抗體效價(jià)。因?yàn)槠鸪鯉状蚊庖弋a(chǎn)生的抗體的效價(jià)比較低，頭兩次取血，夠檢測(cè)用即可。在三次免疫后，可以獲得較價(jià)的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會(huì)造成兔子貧血。zui后一次取血可以采用頸動(dòng)脈放血，具體操作如下：

a.家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚；

b.沿頸部中線(xiàn)用*切開(kāi)皮膚約10cm，分離皮下結(jié)締組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。ㄐ⌒牟僮?，如碰到小血管出血，可用*止血）

c.用直頭*分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后用彎頭*使之游離，剝離神經(jīng)和結(jié)締組織；

d.于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線(xiàn)，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線(xiàn)。近心端的動(dòng)脈用*夾?。?/span>

e.用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科*在兩根絲線(xiàn)間的動(dòng)脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線(xiàn)結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；

f.松開(kāi)*，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

5. 血清的分離：

   如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過(guò)夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過(guò)夜，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入 NaN3 至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。