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細胞 PTEN 活性定磷比色法定量檢測試劑盒實驗步驟

時間:2013-7-29閱讀:1008
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實驗步驟

實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。

 一、 樣品準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好 25cm2細胞培養(yǎng)瓶或 60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞(5 X 106細胞)

2. 小心加入 xx 毫升預(yù)冷的 SBJ 清理液(試劑 A),覆蓋生長表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞

5. 加入 xx 毫升 SBJ 清理液(試劑 A),混勻細胞

6. 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始)

7. 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘,速度為 300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入 xx 微升S B J   裂解液(試劑 B),充分混勻

10.轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

11.強力渦旋震蕩 15 秒

12.置于冰槽里孵育 30 分鐘

13.放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘,速度為 16000g(或 13000RPM)

14.小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

  15.移取 2  微升進行蛋白定量測定

16.即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好待測樣品(例如細胞裂解萃取液等),置于冰槽里(注意:樣品須澄清)

2. 設(shè)定好分光光度儀(溫度為 30℃):波長為 660nm,并置零

3. 準(zhǔn)備好 5 個 1.5 毫升離心管,標(biāo)記為 1 至 5 號管

4. 按下表分別加入S B J   陰性液(試劑 D)和 SBJ標(biāo)準(zhǔn)液(試劑 H)到每個離心管, 混勻

 5. 將 1 至 5 號管放進冰槽里備用,避免光照;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表:

管號

SBJ陰性液(試劑 D

SBJ 標(biāo)準(zhǔn)液(試劑 H

測定體系標(biāo)準(zhǔn)磷濃度

1

0

xx 微升

20 微摩爾/升

2

xx 微升

xx 微升

15 微摩爾/升

3

xx 微升

xx 微升

10 微摩爾/升

4

xx 微升

xx 微升

5 微摩爾/升

5

xx 微升

0

0

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

1. 移取 xx 微升 SBJ 陰性液(試劑 D)到新的比色皿

2. 加入 5 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液

3. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

4. 加入 xx 微升 SBJ終止液(試劑 F),混勻

5. 加入 xx 微升 SBJ 顯色液(試劑 G),混勻

6. 室溫下靜置 15 分鐘,避免光照

7. 即刻放進分光光度儀檢測:獲得吸光讀數(shù)

8. 重復(fù)實驗步驟 1 至 7 四次

9. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y 軸)為吸光單位(A);橫座標(biāo)(X 軸)為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度

    (微摩爾/升)

四、 樣品背景測定

   1. 移取 xx 微升S B J 緩沖液(試劑 C)到新的比色皿

2. 加入 5 微升待測樣品(總量 100 微克細胞裂解萃取液蛋白)

3. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

4. 加入 xx 微升 SBJ 終止液(試劑 F),混勻

5. 加入 xx 微升 SBJ 顯色液(試劑 G),混勻

6. 室溫下靜置 15 分鐘,避免光照

7. 即刻放進分光光度儀檢測:獲得吸光讀數(shù)

8. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對應(yīng)     磷濃度

五、 樣品活性測定

1. 移取 xx 微升 SBJ緩沖液(試劑 C)到新的比色皿

2. 加入 5 微升待測樣品(總量 100 微克細胞裂解萃取液蛋白)

3. 在 37℃溫度下孵育 2 分鐘

4. 加入 xx 微升 SBJ 反應(yīng)液(試劑 E)

5. 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

6. 加入 xx 微升 SBJ 終止液(試劑 F),混勻

7. 加入 xx 微升SBJ顯色液(試劑 G),混勻

8. 室溫下靜置 15 分鐘,避免光照

9. 即刻放進分光光度儀檢測:獲得吸光讀數(shù)

10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對應(yīng)磷濃度

 {[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對應(yīng)磷濃度(微摩爾/升)—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對應(yīng)磷濃度(微摩爾/

升)]X 5(體系倍數(shù))X 樣品稀釋倍數(shù)}÷ 10(反應(yīng)時間;分鐘)=納摩爾磷/毫升/分鐘÷(樣品蛋白濃度) 毫克/毫升=納摩爾磷/毫克/分鐘

 

注意事項

1. 本產(chǎn)品為 25 次操作,包括 5 次標(biāo)準(zhǔn)測定

2. 操作時,避免污染母液

3. 操作時,須戴手套

4. SBJ終止液(試劑 F)和S B J 顯色液(試劑 G)具有腐蝕性,避免直接用手接觸

5. 樣品切忌使用磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理

6. 比色測定后,比色皿須清洗*

7. 如果用戶沒有 660nm 波長,可以使用 600 至 660nm 的任一波長替代

8. 顯示綠色表明具有較強酶活性

9. 空白對照讀數(shù)應(yīng)小于 0.2

10.建議待測樣本蛋白濃度為 100 微克/5 微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量;

11.鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性單位濃度定義:在 37℃溫度下,pH 8.0 的情況下,每單位酶在單位時間內(nèi)(每分 鐘)釋放 1 微摩爾的磷

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確

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