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細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法

時(shí)間:2013-4-12閱讀:368
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細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法


一、形態(tài)學(xué)觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察:凋亡細(xì)胞呈圓形,胞核深染,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)成團(tuán)塊狀,細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
2、丫啶橙(AO)染色,熒光顯微鏡觀察:活細(xì)胞核呈黃綠色熒光,胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺(tái)盼藍(lán)染色:如果細(xì)胞膜不完整、破裂,臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞變藍(lán),即為壞死。如果細(xì)胞膜完整,細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色,則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性,區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察:可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質(zhì)緊實(shí),細(xì)胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。
二、DNA凝膠電泳
(一)、檢測(cè)原理
細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死,其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂,細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA的片斷增加,高分子DNA減少,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA的片斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,出現(xiàn)180-200bpDNA的片斷,而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷,利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡,并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。
(二)結(jié)果判斷
正?;罴?xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶;壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶。
三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測(cè)定
凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA的片斷組成,可由ELISA法檢測(cè)。
(一)檢測(cè)步驟
1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心,其上清液中含有核小體
2、在微定量板上吸附組蛋白體
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合
4、加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合
5、加酶的底物,測(cè)光吸收制。
(二)用途
該法敏感性高,可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞??捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測(cè)。該法不需要特殊儀器,適合基層工作,但是不能測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對(duì)量。

HE染色                                        丫啶橙(AO)染色                          ELISA試劑盒

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