液相色譜法分析人參皂苷
摘要：人參皂甙compound—K（C—K）在人參中的含量極低，但它是其他含量較高的人參皂甙Rbl和Rb2等在人體腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物和zui終吸收形式，具有很高的生物活性。參照藥典2010版采用501液相色譜儀來測定了人參總皂甙發(fā)酵液中c—K的含量。色譜條件為：VertexC18柱；乙腈-水（體積比為48：52）溶液為流動相，流速1.0mL/min；紫外檢測波長203 nm；柱溫35℃；外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：C—K的質(zhì)量濃度為0.05～0.8g/L時，其峰面積與質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9998。方法的檢測限（S/N=3）為2.5mg/L，峰面積測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為2.2%。測定栽培人參總皂甙及三七莖葉總皂甙微生物發(fā)酵液中c—K 的平均加標(biāo)回收率（ n=3）分別為98.6%和99.7%。該方法快速簡便，準(zhǔn)確可靠，可用于c—K 的制備研究及藥物開發(fā)。
關(guān)鍵詞：液相色譜法；501液相色譜儀，人參皂甙compound—K；人參；三七
人參在我國和東亞的應(yīng)用已有數(shù)千年，作為滋補(bǔ)強(qiáng)身的藥材也已聞名*。人參皂甙（ginsen—oside）被認(rèn)為是人參各種藥理和生物活性的主要有效成分，屬于三萜皂甙，其中人參皂甙Rbl，Rb2。Rc，Re和Rgl等含量較高。人參皂甙compound-K（C-K）[20-O-D-glucopyranosyl-20-（S）-proto-panaxadio1]，其分子式為C16H64O8 ，在人參中的含量極低，但它是人參皂甙Rbl，Rb2和Rc在人體腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物和zui終吸收形式。近年來，體內(nèi)體外試驗研究發(fā)現(xiàn)，許多生物學(xué)活性都是由該化合物引起的，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，抗過敏，抑制化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的染色體基因突變等 ，因此對它的研究越來越受到重視。目前，C—K主要是通過微生物發(fā)酵法和酶法獲得 。C—K含量測定方法學(xué)的研究對人參皂甙發(fā)酵液及其制品的質(zhì)量控制、發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及C—K體內(nèi)代謝吸收的研究均有十分重要的意義。采用液相色譜法（HPLC）測定人參皂甙含量，在國內(nèi)外均有報道 ，而有關(guān)人參及其制品中C—K的含量測定則未見報道。本文采用反相液相色譜法（RP—HPLC）測定栽培人參總皂甙和三七莖葉總皂甙微生物發(fā)酵液中C—K的含量，方法具有簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，且樣品經(jīng)提取、濃縮、定容后不需要進(jìn)一步純化。
l 實驗部分
1．1 儀器、試劑及樣品
501二元梯度泵；可變波長紫外檢測器和GLP色譜工作站；Acculab ALC一1 l0．4型分析天平（德國Sartorius公司）；RE一52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。甲醇、乙醇（分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司）；乙腈（HPLC純，DIKMA公司）；超純水（由德國Sartori—US公司Arium 631系列實驗室超純水器制備）。C-K標(biāo)準(zhǔn)品：本實驗室自制；栽培人參總皂甙：撫順鑫泰參茸保健品公司提供，總皂甙含量81．56％ （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；三七莖葉總皂甙：云南紅云生物技術(shù)公司提供，總皂甙含量80．52％ （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。
1．2 色譜條件
色譜柱：VertexC18 4.6×250mm,5um；流動相：乙腈-水（體積比為48：52）溶液，流速1.0mL／min；檢測波長：203nm；柱溫：35℃ ；進(jìn)樣量：l0uL。
1．3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取C-K標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用甲醇溶解并定容至5mL，配制成1.0g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。從中準(zhǔn)確吸取適量配成0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1．4 樣液的制備
1．4．1 人參總皂甙樣液的制備
分別準(zhǔn)確稱取30.0mg栽培人參總皂甙和三七莖葉總皂甙，各用甲醇配成10mL質(zhì)量濃度為3g／L的溶液，經(jīng)0.45m濾膜過濾后作為測定樣液。1.4.2人參總皂甙發(fā)酵液樣品溶液的制備取栽培人參總皂甙和三七莖葉總皂甙的發(fā)酵液各30mL（人參總皂甙質(zhì)量濃度為5g／L），先用30mL乙醇浸提24h，再過濾除去菌體。濾液減壓蒸干后，用5mL甲醇溶解，將溶解液高速離心（12000r／min）lOmin。準(zhǔn)確移取上清液1mL，用甲醇稀釋30倍，經(jīng)0.45 izm 濾膜過濾后供試。
1．5 定量方法
采用外標(biāo)法定量。以峰面積對質(zhì)量濃度做工作曲線，再由試樣中組分的峰面積求出試樣中組分的實際濃度。
2 結(jié)果與討論
2．1 人參皂甙compound-K 的色譜行為本研究在乙腈一水流動相體系中進(jìn)行，選擇乙腈與水的體積比分別為30：70，43：57，48：52，55：45，60：40，結(jié)果以乙腈與水的體積比為48：52的分離效果。在此條件下不僅C—K與其他皂甙類成分達(dá)到基線分離，而且峰形好，檢測靈敏度高。C—K標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)酵前后栽培人參總皂甙及三七莖葉總皂甙的色譜圖見圖1。
結(jié)語
本方法的建立為菌株改良、發(fā)酵與分離工藝優(yōu)化，提高發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和分離提取的收率提供了一個有效的分離分析手段，為實現(xiàn)人參皂甙compound．K生產(chǎn)工業(yè)化及開發(fā)抗腫瘤新藥奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
人參皂苷、三七皂苷液相色譜法
[1] Akao T，Kida H，Kanaoka M ．Hattori M．Kobashi K JPharm Pharm acol，2011． 50：l l55
[2] Lee S J，Sung J H，Lee S J，Moon C K．Lee B H．CancerLetters，2011，l44（1）：39
關(guān)鍵詞：501液相色譜儀，人參皂苷，液相色譜法
