園藝植物制片方法

        植物制片是進行園藝植物科學研究所需用的一種基本方法，比如進行植物各個器官的解剖構造觀察、花芽分化研究、授粉受精觀察、貯藏營養(yǎng)觀測以及染色體觀察等都需要進行制片。通過對切片結果的分析，可以比較不同試驗處理的效果以及了解不同樹種和品種相應的生物學特性等。植物制片技術是一個相對獨立的體系，內容繁多。在本章內容中，將介紹在園藝植物科學研究中常用的一些基本方法和原理。

                                      第yi節(jié)  徒手制片

一、徒手制片（切片）及特點

        徒手制片一般指徒手用刀片把新鮮的植物材料切成薄片的制片方法。

此制片法主要優(yōu)點是：（1）能及時觀察研究植物生活組織的結構和天然色彩；（2）方法及用具簡單，不需切片機等機械設備，短時間即可完成。主要缺點是（1）對于微小、柔軟、水分過多以及堅硬的材料，難以用徒手切成薄片；（2）對于操作不熟練者，往往切成厚薄不勻或不完整的切片。

二、徒手制片的方法及注意事項

        徒手制片 zhu yao 的工具就是刀片，常可用單面保安刀片。要獲得良好的切片，首先要保持刀口的鋒利。切片方法及步驟為：

（1）準備工作（盛好清水的培養(yǎng)皿、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刀片等用具）。

（2）拿取材料進行切片，材料可以是新鮮的材料，也可以是經(jīng)過固定的材料（切片時，將欲切材料斷面和刀片上滴上清水以保持材料濕潤）。

（3）以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指應低于食指，以免切傷手指；材料高出指尖。

（4）右手執(zhí)刀，將刀平放在食指上，刀口朝內，刀面與材料斷面平行，然后以均勻快捷的動作自左前方向右后方以臂力帶動刀片水平切割移動，不要用腕力。同時還要注意，切時動作要迅速，材料一次切下，切忌停頓或拉鋸式切割。

（5）連續(xù)切數(shù)片后，將切下的薄片輕輕移入盛水的培養(yǎng)皿中備用。然后挑選薄而透明的切片，放在載玻片上的水滴中，加上蓋玻片制成臨時制片進行觀察。

        在試驗中，有時因各種情況所取材料無法馬上進行制片?？梢詫⑵浔４嬖诠潭ㄒ褐?，常用的固定液為F.A.A固定液，它不但是優(yōu)良的固定液也是優(yōu)良的保存液 ，其配方為：5ml福爾馬林（甲醛）：5ml冰醋酸：50-70%的乙醇90ml。

        用徒手切片的材料不宜過大，一般以表面不超過5-8mm² 為宜。對于過于柔軟或微小的材料（如葉片、細小的根尖等）需要借助一些夾持物方可進行切片，如果臨時制片需保存一段時間，（1）將材料封在水中，每隔20-30分鐘再加一滴水，此法可保持數(shù)小時；（2）用10%-30%的甘油水溶液代替清水封片，并將制片放在鋪有濕濾紙的大培養(yǎng)皿中保存，或用石蠟或指甲油封邊保存，可保存1-2周或更長時間。

                                      第二節(jié)  壓片及涂片

 涂片和壓片是進行植物染色體觀察研究常用的制片方法。

        涂片是將新鮮的材料或者是經(jīng)過固定的材料于載片上，托涂成均勻一層，經(jīng)染色后蓋上蓋玻片鏡檢。     

         壓片是將處理后的材料于載片上分散后加蓋片，用拇指或鑷子輕輕擠壓蓋片，使組織分散成一片，然后鏡檢。

         進行染色體觀察時注意，若進行染色體數(shù)目測定要求取樣個體數(shù)在5個以上，細胞總數(shù)在30個以上；若進行染色體核型分析（組型分析)則要求取樣應是來源于不同個體的5個細胞。

一、常規(guī)壓片法

1.取材：于細胞分裂旺盛時期取樣。一般取根尖、莖尖。

2.預處理：防止紡錘體的形成，使細胞分裂停止在中期階段；使染色體收縮變短，便于觀察統(tǒng)計。常用藥劑有秋水仙堿溶液、8-羥基喹啉、對二氯苯飽和水溶液、富民隆。預處理的時間一般為2-12小時。

3. 固定：把細胞迅速殺死，使蛋白質變性沉淀，盡量保持材料結構的原有狀態(tài)，以備進一步處理。

 常用的固定液為卡諾固定液，即3：1的純酒精:冰醋酸溶液。固定時間一般為1-24小時。

4.解離：根尖、莖尖等體細胞組織，需經(jīng)過某些處理，除去細胞之間的果膠層并使細胞軟化，這種細胞分離和軟化后的組織才便于壓片。 chang yong 的是酸水解和酶處理兩種。

５．染色：?？捎面跔柛旧ɑ虼姿嵫蠹t等核染色劑進行染色。

６．壓片：將材料移至載玻片上，蓋上蓋玻片，用解剖針或用鉛筆的橡皮頭在蓋玻片上輕輕敲擊，使細胞分散，再用拇指輕擠壓蓋片使組織成為一薄層。

７．鏡檢：將壓片置于顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細胞進行統(tǒng)計記數(shù)，并可照相繪圖，以便進行核型分析。同時可用記號筆在載玻片和蓋玻片上分別做記號，以便再次觀察和照相。

８．封固：好的壓片，可采用冷凍干燥后，用光學樹膠封固保存。也可進行脫水透明等步驟制成永jiu切片。若臨時保存，可以用石蠟封邊，放于培養(yǎng)皿中于冰箱冷凍室內短期保存。

二、去壁低滲法（涂片法）

1.取材：同上述常規(guī)壓片法。

2.預處理（前處理）：同上述常規(guī)壓片法。

3.前低滲：將處理后的材料防災0.075M KCl低滲液中，在20-25℃條件下處理30分鐘左右.

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具B染色體的黑麥基因組核型

4．去壁：倒去KCl溶液，加入2.5%混合酶液（纖維素酶與果膠酶各占2.5%），在溫度25-30℃下處理2-5小時左右。酶液與材料的比例適當，酶液不能過少。

5. 后低滲：倒去酶液，用蒸餾水沖洗2-3次，然后在蒸餾水中停留5-10分鐘左右后進行后低滲。

6. 固定：用甲醇:冰醋酸（3:1）固定液固定。

7. 涂片：將去壁固定的材料放在載玻片上，加一滴固定液，然后用鑷子將材料夾碎，去掉大塊殘渣，然后從載玻片一側向材料輕輕吹氣，使組織分散成一薄層。

8. 火焰干燥：將載片于酒精燈上微微加熱烤干。

9．染色：用40:1的Giemsa染液染色4-30分鐘或更長，蒸餾水清洗，空氣干燥后可用樹膠封片。

10. 鏡檢：于顯微鏡下觀察。

                                                       第三節(jié)  石蠟制片

        石蠟切片是光學顯微鏡的制片技術中 chang yong 的一種方法，屬于永jiu制片。一般的植物材料都可以用此法制片。但有制作時間較長，操作過程復雜以及材料易發(fā)硬或發(fā)脆等缺點。

操作程序如下：

1. 材料的采集與分割：根據(jù)制片的目的和要求采集材料，材料要有代表性。材料采后應盡快進行分割固定。為使固定液能迅速的滲透材料，要進行材料分割。分割塊宜小不宜大，一般不超過1cm3，分割后立即殺死固定。
2. 殺死與固定：利用藥劑迅速把細胞殺死，以保持材料本來的狀態(tài)和結構。常用的固定液有F.A.A固定液、卡諾固定液等，前者還可作保存液。

3.脫水：除去組織中的水分，便于透明、浸蠟、包埋等步驟的進行。常用的脫水劑為酒精。脫水采用等級脫水（系列脫水），即從較低濃度酒精開始，逐漸替換到高濃度酒精。

4.透明：將脫水劑從材料中除去，使材料透明，增加折光系數(shù)；便于下步的浸蠟和包埋等程序。透明劑是一種既能與脫水劑混合，又能與包埋劑混合的藥劑。常用的透明劑為二甲苯和lu fang，適用原則也是逐級進行，可減少材料收縮。   

5.浸蠟：逐漸除去透明劑,并為包埋劑所代替。常用的包埋劑是石蠟。浸蠟過程是使石蠟慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟漸漸深入到材料的細胞中去， hou使透明劑*被石蠟取代，以便切片。

6.包埋：將浸蠟后的材料包埋在石蠟中。此步驟要迅速，且不要使石蠟塊中有氣泡。注意將樣品編號封于蠟塊上，以免樣品混淆，以備切片。

7.修塊和切片：將已包埋好的蠟塊切成小塊，每一小塊包含一塊材料。然后按照所需的切面，進行修整。把蠟塊粘接在載蠟器上，用切片機將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶。

8.粘片：將切下來的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時先在載玻片上滴上一小滴粘片劑，加幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用撥針將切片伸直、展平，傾斜載片，使水流去并烘干。

9.脫蠟、染色、脫水透明和封片：粘片后要經(jīng)過脫蠟、染色、再次脫水透明，然后封片永jiu保存。

         脫蠟、染色和脫水透明的過程仍采用等級法逐漸進行。 hou加拿大樹膠封片，然后貼標簽鏡檢及保存。

         以上是石蠟制片的一般步驟；為了獲得良好的制片效果，需要制片者的大量實踐并在實踐中不斷摸索、積累經(jīng)驗方可。

亮葉忍冬葉片解剖構造

韭菜根橫切面

女貞莖橫切面（皮孔）

南瓜莖橫切面局部

                                                     第四節(jié)   電鏡制片

        電子顯微鏡（簡稱電鏡）大體上分兩類，一是掃描電鏡，二是透射電鏡。掃描電鏡能直接觀察到樣品表面的三維立體結構，如植物的花、葉、果實的表面結構等；投射電鏡可觀察到植物組織的超微結構，如葉綠體的膜結構韌皮部疏導組織結構等等。它們的制片方法有很大不同。

一、掃描電鏡常規(guī)制片方法

（一）取材

        基本要求是 ：動作應迅速、部位要準確 ；刀片要鋒利；尺寸不宜過大 ；采取易分散的材料，要注意防塵、樣品分散；數(shù)量必需取夠。

（二） 清洗

        共清洗3次。  清洗掉樣品表面雜質等附著物； 除掉沒有和樣品成分發(fā)生反應的固定劑。常用的清洗液有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液以及含酶的清洗液，可依具體情況選擇 。

（三）固定  

        目的是 盡量完善的穩(wěn)定和保存樣品細胞內的各種成分和結構，使其接近生活時的狀態(tài)。 常用的方法是戊二醛—si yang hua e 雙固定法。先用1-3%的戊二醛/緩沖液固定數(shù)分鐘至數(shù)小時，再用1%鋨酸/緩沖液在4℃下固定30-60min。

（四）脫水和置換

采用系列乙醇或丙酮逐級脫水，一般為：    

30%→50%→70%→80%→95%→百分之一百，每步15-20min。

（五）干燥

        是制片關鍵一步。目的是去除樣品中的游離水或已取代游離水的脫水劑，使樣品中不含有液態(tài)物質 。臨界點干燥法是目前*的較好方法。

（六）粘樣

         將干燥好的樣品用導電膠將樣品粘在樣品臺上，并做好標記。常用的有銀粉導電膠、石墨粉導電膠、雙面膠帶、普通膠水等。

（七）鍍膜（噴涂）

         是把粘貼到樣品臺上的樣品和樣品臺表面同時噴涂上一層金屬膜，使樣品具有良好的導電性，以便下一步觀察。一般噴涂10-20nm厚的金屬膜，常用的金屬有金、銅、鋁、金-鈀。

（八）觀察

         噴好的樣品就可以用掃描電鏡進行觀察了（一般20kv）。如果一時不能觀察，需把樣品放入干燥器中保存，以防受潮或被污染。

OK！

掃描電子顯微鏡

蘋果花粉粒

蜀葵花粉粒

一串紅花粉粒

二、透射電鏡制片基本方法（超薄切片）

（一）取樣

        要求取樣要有代表性、迅速、準確、及時、體積小、低溫、防損傷。一般要求體積0.5-1.0mm2。

（二）固定

        目的是要在分子水平上真實的保存細胞超微結構的每一細節(jié)。常用的方法是化學固定法，目前大部分植物材料采用的固定方法是戊二醛—鋨酸雙固定法，即先用戊二醛作預固定，然后用鋨酸作后固定。對于一般植物葉、幼莖、幼根可用3%的戊二醛固定2小時，用1-2%si yang hua e 固定2-3小時。

（三）脫水

        常用的脫水方法是逐級脫水，即采用的脫水劑濃度梯度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→百分之一百（百分之一百 濃度中換3次），常用的脫水劑為乙醇或丙酮。每一級脫水劑中停留時間為10-20min，脫水劑用量一般為樣品體積的10倍以上。

（四）滲透與包埋

        將脫完水的組織先后經(jīng)過脫水劑和環(huán)氧樹脂滲透液（是常用的包埋劑，目前常用的型號為Epon812），比例分別為3：1→1：1→1：3，每步30-60min。將滲透好的樣品塊放到適當模具中，灌上包埋液包埋，經(jīng)過加溫聚合形成一種固體基質（也叫包埋塊），已備切片。

（六）超薄切片

        標準的超薄切片應該是厚度適中、均勻、平整、無刀痕、無顫紋和皺褶?；静襟E為：準備切片刀和銅網(wǎng)→修整包埋塊→切片→撈片。

        銅網(wǎng)準備：超薄切片要放在載網(wǎng)上才能進行染色等操作，并 zhong 放到電鏡中觀察。載網(wǎng)是用無磁性金屬材料做成的，厚50微米，直徑一般為3mm，一般用銅材料，所以又叫銅網(wǎng)。銅網(wǎng)要經(jīng)過清洗，方可使用。目前清洗方法主要有：超聲波清洗法、酸堿清洗法。

        支持膜的準備：銅網(wǎng)的網(wǎng)孔很小，但對于放置超薄切片及其他樣品來說，網(wǎng)孔還嫌大，不足以平坦地支持切片，所以要在銅網(wǎng)上覆一層透明的膜——支持膜。

切片刀準備：超薄切片刀有兩種，一是金剛刀，二是玻璃刀。前者價格昂貴、質地堅硬、經(jīng)久耐用；后者制作方便、價格低廉、但刀刃較脆、不耐用、不能切硬質材料。制刀用玻璃為硬質玻璃，含硅量72-75%以上。

        切片：是用超薄切片機切出50nm后左右的超薄切片，以供觀察。

         展片與撈片：切下的超薄切片漂浮在刀槽液面上，需要將它撈至于銅網(wǎng)上，才能染色和電鏡觀察。由于切片很薄，在切片過程中易皺褶，使樣品結構重疊，因此在撈片前需進行展片。撈片后，用濾紙吸去多余水分，然后將載網(wǎng)放入樣品盒，至于干燥器中保存，待染色。

（七）切片染色（電子染色）

        要進行電子染色后才利于電鏡觀察。所謂電子染色是使鈾、鉛、鋨、鎢等重金屬鹽類中的重金屬與組織中某些成分結合或被吸附，以此達到染色目的。經(jīng)過電子染色處理可以提高樣品的反差，增加圖像的清晰度。常用的電子染色劑有醋酸鈾和鉛鹽。常用的染色方法是雙染色法，即先用醋酸鈾染色，然后再用檸檬酸鉛染色。染色時間，室溫下染色15-20min。

（八）電鏡觀察

        染色完成的樣品立即上機觀察，如受時間限制，樣品應放置于干燥器中防受潮。

透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡

油菜花粉粒-小孢子胚胎發(fā)生誘導

油菜花粉粒單核液泡期

NaCl+Si處理

Ch：葉綠體

SG：淀粉粒