來自暨南大學(xué)理工學(xué)院，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所的研究人員針對乳腺癌位點：rs4784227（C>T）, rs1219648（G>A）和 rs3803662（T>C），利用一種簡單方法，獲得三個位點的分型結(jié)果，建立了單管多重PCR同時檢測這些位點的新檢測方法。這一研究成果公布在《中國科學(xué)—生命科學(xué)》（Scientia Sinica Vitae）雜志上。
乳腺癌是女性zui常見的惡性腫瘤之一。已有研究表明, 易感基因 FGFR2（fibroblast growth factor receptor 2）和 TNRC9（the trinucleotide repeat containing 9）的變異對 ER+（estrogen receptor-positive）乳腺癌的影響明顯。TNRC9基因上的 rs4784227（C>T）多態(tài)是基于中國女性篩選出的易感位點，rs1219648（G>A）和rs3803662（T>C）分別為 FGFR2與 TNRC9基因的主要研究對象，是導(dǎo)致中國女性乳腺癌惡性程度加深的遺傳因子。因此針對這3個位點建立多重檢測方法具有臨床應(yīng)用價值，可作為乳腺癌高危人群預(yù)防和早期治療的參考依據(jù)。
在近年來出現(xiàn)的多種單核苷酸多態(tài)性SNP檢測技術(shù)中，四引物擴增受阻突變體系 PCR（tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, T-ARMS-PCR）或兩對交叉引物 PCR（PCR with confronting two-pair primers, PCR-CTPP）因其操作簡便、分型快速、費用低廉而被廣泛應(yīng)用。
這種方法的原理為針對已知的突變, 在突變點的兩側(cè)分別設(shè)計一對外引物和一對特異性內(nèi)引物, 特異性內(nèi)引物用來檢測突變是否發(fā)生, 外引物在PCR 反應(yīng)中和特異性內(nèi)引物配對, 從而選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。特異性內(nèi)引物的設(shè)計保證了在同一次擴增中野生型和突變型基因產(chǎn)生的擴增片段長度不同, 因此可以通過產(chǎn)物電泳圖譜中特定條帶的有無判別個體的基因。
但是目前T-ARMS-PCR方法仍以單重檢測為主, 少數(shù)實驗室也能實現(xiàn)多重檢測（Multiplex-T-ARMS-PCR, M-T-ARMS-PCR）, 但其可同時檢測的位點數(shù)量難以進一步提高, 主要受到兩個限制——多重擴增的偏向性及瓊脂糖電泳的分辨率。
在這篇文章中，研究人員通過引入多重嵌合引物PCR技術(shù)對T-ARMS-PCR進行了改進, 在擴增初期使用特異性嵌合引物（即在特異性引物 5′端引入通用序列）擴增, 而擴增末期由通用引物引發(fā)擴增, 從而在保證反應(yīng)特異性的同時, 降低了多重PCR 的偏向性。
此外, 研究人員還應(yīng)用分辨率較高的毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE）替代瓊脂糖電泳, 建立了單管多重 PCR 同時檢測乳腺癌相關(guān)位點rs4784227 （C>T）, rs1219648（G>A）和 rs3803662（T>C）的三位點檢測方法。
采用T-ARMS-PCR 方法進行SNP分型, 僅需一次PCR擴增和一次瓊脂糖電泳即可達到目的。這項研究采用嵌合引物擴增和毛細管電泳對T-ARMS-PCR進行改進, 建立了一種M-T-ARMS-PCR的SNP分型方法。
并且這項研究也在成功對全血樣品進行分型的基礎(chǔ)上，通過進一步優(yōu)化實驗條件實現(xiàn)了對濃度更低的口腔拭子樣本的準確分型。在18份口腔拭子DNA標本通過實驗全部實現(xiàn)了準確判別。由此可見, 這一方法可以應(yīng)用于臨床, 可以在口腔拭子等非常少量 DNA 的基礎(chǔ)上, 同時獲得多個位點的分型結(jié)果, 是一種準確的SNP分型方法, 有很好的應(yīng)用前
