[基因組編輯工具新工具：改造Cre重組酶]

ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系統(tǒng)是當(dāng)今十分流行的基因組編輯工具，但它們并不是*的選擇。位點(diǎn)特異的重組酶也很有用。如今，哈佛大學(xué)的研究人員報(bào)告了一個(gè)重組酶的突變體（Cre），其特異性比野生型的酶要高得多，這一特點(diǎn)對(duì)基因治療應(yīng)用來(lái)說(shuō)吸引力。

Nikolai Eroshenko 是哈佛大學(xué)工程和應(yīng)用*的研究生。他和他的導(dǎo)師—的遺傳學(xué)家 George Church —在《自然-通訊》上發(fā)表了他們的研究成果。

Eroshenko 的研究方向是人類(lèi)基因治療，也就是用野生型或“正確”的副本來(lái)替換突變基因。但是，將這一副本插入基因組卻并不容易。研究人員可以使用病毒，但無(wú)法控制整合位點(diǎn)。引入雙鏈 DNA 斷裂的核酸酶是另一種選擇，但它們需要同源重組的修復(fù)，這在人類(lèi)細(xì)胞中相當(dāng)罕見(jiàn)。

Cre 等重組酶在人類(lèi)細(xì)胞中非常，也不需要內(nèi)源的 DNA 修復(fù)。為了使用它們，研究人員必須改造重組酶結(jié)合位點(diǎn)（ loxP ）和待插入的 DNA ，剩下的就由酶來(lái)完成。一般來(lái)說(shuō)，重組酶過(guò)程被認(rèn)為相當(dāng)特異。然而，一些證據(jù)也表明脫靶效應(yīng)的可能性。

為了提高 Cre 的特異性， Eroshenko 利用數(shù)學(xué)建模來(lái)確定改善蛋白準(zhǔn)確性而又不犧牲效率的策略。他發(fā)現(xiàn)，針對(duì) Cre 形成二聚體能力（而不是與 DNA 結(jié)合）的突變有可能會(huì)成功。

隨后 Eroshenko 利用 PCR 突變法來(lái)改造蛋白 N 端附近的 α 螺旋，它參與了二聚化，而未參與 DNA 結(jié)合。利用雙選擇策略，他確定了三個(gè)突變體，它們?nèi)急Ａ袅苏_靶定 loxP 位點(diǎn)的能力，但又避開(kāi)與 loxP 相似的假序列。他在體外以及細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)將這些突變體與野生型的 Cre 重組酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)酶的效率稍低，但更加特異。

在大腸桿菌中，Eroshenko 觀察到野生酶的錯(cuò)誤率約為 1/10,000 個(gè)細(xì)胞。“我們有些突變體要高三個(gè)數(shù)量級(jí)或以上。”

Eroshenko 表示他的長(zhǎng)期目標(biāo)是重新改造重組酶，讓它靶定 loxP 之外的位點(diǎn)，如人類(lèi)基因組中已經(jīng)存在的內(nèi)源 pseudo- loxP 位點(diǎn)，這樣重組酶就可以用于未經(jīng)修飾的基因組。

不過(guò)，梅約診所的助理教授 Karl Clark 對(duì)此結(jié)果表示很驚訝。他本人也在研究基因組編輯工具，包括重組酶 Cre。“我沒(méi)有聽(tīng)到很多人抱怨 Cre/loxP 是非選擇性的，”他說(shuō)。

Clark 表示，他計(jì)劃在其實(shí)驗(yàn)室中嘗試這些新的突變體，看看它們是否在斑馬魚(yú)中起作用。他指出，對(duì)于許多應(yīng)用，如轉(zhuǎn)基因應(yīng)用，利用 Cre 來(lái)短暫激活沉默的基因，野生酶的準(zhǔn)確性已足夠。 {試劑酶聯(lián)網(wǎng)：www.shjgogo.com}   ELISA試劑盒相關(guān)產(chǎn)品推薦：

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