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技術(shù)文章

人(Human)血管生成素II(Ang II)Elisa試劑盒作用分析

閱讀:818發(fā)布時(shí)間:2013-6-8

人(Human)血管生成素II(Ang II)試驗(yàn)原理

Ang II試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA.已知Ang II濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將Ang II和*標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物AB,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中Ang II的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份(2-8℃保存)

96孔配置

48孔配置

配制

96/48人份酶標(biāo)板

1塊板(96T

半塊板(48T

即用型

塑料膜板蓋

1

半塊

即用型

標(biāo)準(zhǔn)品:400pg/ml

1瓶(0.6ml

1瓶(0.3ml

按說明書進(jìn)行稀稀

空白對(duì)照

1瓶(1.0ml

1瓶(0.5ml

即用型

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液

1瓶(5ml

1瓶(2.5ml

即用型

*標(biāo)記的抗Ang II抗體

1瓶(6ml

1瓶(3.0ml

即用型

親和鏈酶素-HRP

1瓶(10ml

1瓶(5.0ml

即用型

洗滌緩沖液

1瓶(20ml

1瓶(10ml

按說明書進(jìn)行稀釋

底物A

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

底物B

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

終止液

1瓶(6.0ml

1瓶(3.0ml

即用型

人(Human)血管生成素II(Ang II)自備材料

1. 蒸餾水。

2. 加樣器:5ul10ul、50ul、100ul、200ul500ul、1000ul

3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。

2. 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項(xiàng)

1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。

2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。

3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物AB液時(shí),避免使用帶金屬部分的加樣器。

5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6. 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感,避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

9. 按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

人(Human)血管生成素II(Ang II)樣品收集、處理及保存方法

1、 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備

1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備,不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:

400 pg/ml

6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

200 pg/ml

5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

100 pg/ml

4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

50 pg/ml

3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

25 pg/ml

2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

12.5 pg/ml

1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0 pg/ml

(空白對(duì)照)

原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟

1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時(shí)加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。

2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時(shí)。

4. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。

5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。

6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。

7. 每孔加入底物AB50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。

8. 取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9. 450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/ml

A

400

400

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

B

200

200

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

C

100

100

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

D

50

50

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

E

25

25

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

F

12.5

12.5

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

G

0

0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

H

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

局限

6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性:不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%

結(jié) 果 判 斷 與 分 析

1、儀器值:于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD

2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的Ang II標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的Ang II含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3檢測值范圍:0-400pg/ml

4、敏感度: 1.0 pg/ml


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