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人腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
檢測范圍： 96T
20 ng/L -400 ng/L
使用目的：
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中腫瘤壞死因子 α （TNF- α）含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人腫瘤壞死因子 α （TNF- α）水平。用純化的
人腫瘤壞死因子 α （TNF- α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次
加入腫瘤壞死因子 α （TNF- α），再與 HRP 標記的腫瘤壞死因子 α （TNF- α）抗體結(jié)合，
形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催
化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子
α （TNF- α）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度 （OD 值），通過標準曲線計
算樣品中人腫瘤壞死因子 α （TNF- α）濃度。
人腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒說明書
試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液 20ml ×1 瓶 7 終止液 6ml ×1 瓶
2 酶標試劑 6ml ×1 瓶 8 標準品 （800ng/L） 0.5ml ×1 瓶
3 酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml ×1 瓶
4 樣品稀釋液 6ml ×1 瓶 10 說明書 1 份
5 顯色劑 A 液 6ml ×1 瓶 11 封板膜 2 張
6 顯色劑 B 液 6ml ×1/瓶 12 密封袋 1 個
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20 ℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的 （HRP ）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
400 ng/L 5 號標準品 150µl 的原倍標準品加入 150µl 標準品稀釋液
200 ng/L 4 號標準品 150µl 的5 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液
100 ng/L 3 號標準品 150µl 的4 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液
50 ng/L 2 號標準品 150µl 的3 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液
25 ng/L 1 號標準品 150µl 的2 號標準品加入 150µl 標準品稀釋液
2. 加樣：分別設空白孔 （空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl，
然后再加待測樣品 10µl （樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3 。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應 （此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度 （OD 值）。 測定應在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
操作程序總結(jié)：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的
OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，
即為樣品的實際濃度。
注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2 ．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3 ．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4 ．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高 （樣本 OD 值
大于標準品孔*孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù) （n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù) （×n×5）。
5 ．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6 ．底物請避光保存。
7 ．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9 ．本試劑不同批號組分不得混用。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2 ．有效期：6 個月
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