（一）準(zhǔn)備和安裝過(guò)濾器
清洗好過(guò)濾器，干燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進(jìn)行高壓滅菌處理。 在超凈臺(tái)內(nèi)打開過(guò)濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過(guò)濾，過(guò)濾后要檢查濾膜是否完好無(wú)損。
（二）合成培養(yǎng)基的配制
1、根據(jù)細(xì)胞目錄中的說(shuō)明，按下表選擇合適品牌及貨號(hào)的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解。
| 培養(yǎng)基 | 品牌 | 貨號(hào) |
| D-MEM/F-12 | GIBCO | 12400024 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium （D-MEM）, powder （high glucose） | GIBCO | 12800017 |
| F-12 Nutrient Mixture （Ham） powder | GIBCO | 21700075 |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium （IMDM） powder | GIBCO | 12200036 |
| Leibovitz's L-15 Medium powder | GIBCO | 41300039 |
| McCOY's | SIGMA | M4892 |
Minimum Essential Medium （MEM） Alpha Medium powder （MEMα）
with ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 11900024 |
Minimum Essential Medium （MEM） Alpha Medium powder （MEMα）
without ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 12000022 |
| Minimum Essential Medium （MEM） powder | GIBCO | 41500034 |
NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S
MODIFICATION （F12K） | SIGMA | N3520 |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO | 31800022 |
| EGF | SIGMA | E9644 |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256-25G |
| MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED | SIGMA | M5017 |
2、 按要求添加*、*鈉、HEPES等，充分?jǐn)嚢枋怪芙狻?br /> 3、 調(diào) pH至7.2左右。
4、 加水至zui終體積。
5、 在超凈臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行濾過(guò)除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。
6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。
（三）小牛血清的處理 市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補(bǔ)體（近來(lái)也有觀點(diǎn)認(rèn)為熱滅活處理是不必要的）。胎牛血清不必滅活。
1、 將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。
2、 處理后的血清貯存于4℃。
3、 小牛血清在使用前進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。
（四）生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制 除無(wú)血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
- 培養(yǎng)基分裝成小瓶（100～200 mL）以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。
- 按如下比例配制： 基本培養(yǎng)基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液（*+*），使*和*的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL，。
（五）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
- 應(yīng)遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37。5度，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。
- 在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)將*培養(yǎng)基加入50ml的小培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，約5ml左右，然后用無(wú)菌吸管從凍存管內(nèi)取出細(xì)胞，置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃，使細(xì)胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
（六）傳代:
- 貼壁細(xì)胞:
對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸（倒）盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強(qiáng)度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進(jìn)行消化，（根據(jù)經(jīng)驗(yàn)），晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml*培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。
- 懸浮細(xì)胞:
一般傳代可直接將細(xì)胞原液分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入*培養(yǎng)基，輕輕吹勻后，分置其它培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
（七）凍存
將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以*培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜。次日保存到液氮中。
（八）注意事項(xiàng)
- 玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1）高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2）干烤消毒140度2小時(shí)以上;
- 無(wú)菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上;
- 培養(yǎng)基（pH7.2）和血清配制好后要做無(wú)菌試驗(yàn):將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無(wú)渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存;
- 消化液（pH7.8）或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝成支置-20度保存;
- 培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來(lái)菌）。至少每月一次。
- 進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無(wú)菌臺(tái)內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來(lái)往，如果數(shù)量較多，培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離，開瓶（蓋）時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒，打開后應(yīng)用燈先燒口，然后燒蓋。用完后同樣操作。整個(gè)操作過(guò)程盡量在無(wú)菌臺(tái)靠里面一點(diǎn)。
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