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實(shí)驗(yàn)原理

1. DNA ） 片段回收方法：DNA ）片段在適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進(jìn)行電泳，不同大小的DNA 分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA） 片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
2. 利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)，可用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）
2. TAE電泳緩沖液
3. 瓊脂糖（Agarose）
4. 6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍(lán)，40％（w/v） 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
5. 溴化乙錠（EB）溶液母液：配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲(chǔ)于室溫即可。
6. 70%乙醇
7. 膠回收試劑盒（Omega公司）

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 水平式電泳裝置

2. 電泳儀

3. 臺(tái)式高速離心機(jī)

4. 恒溫水浴鍋

5. 微量移液槍

6. 微波爐或電爐

7. 紫外透射儀

8. 凝膠成像系統(tǒng)或其它照相設(shè)備

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物（以O(shè)mega公司 Gel Extraction Kit為例）

   1） 當(dāng)目的片段DNA*分離時(shí)，轉(zhuǎn)移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段。
   2） 凝膠塊轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管（離心管已經(jīng)稱重了）中，稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積（假設(shè)其密度為1g/ml）。加入等體積的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠*融化，每2-3 min振蕩混合物。（在凝膠*溶解之后，注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產(chǎn)量將大大減少。如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5 M，pH為5.2的醋酸鈉，以調(diào)低其pH值。該混合物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色。）
   3） 取一個(gè)干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集管內(nèi)（已備好）。
   4） 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉(zhuǎn)移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。
   5） 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul，一次只能轉(zhuǎn)移700ul至柱子中，余下的可繼續(xù)重復(fù)第5步至所有的溶液都經(jīng)過柱子。每一個(gè)Hibind DNA回收純化柱都有一個(gè)極限為25μg DNA的吸附能力。如果預(yù)期產(chǎn)量較大，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱子中。
   6） 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。轉(zhuǎn)移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室溫下， 10,000 x g下離心1min。
   7） 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。轉(zhuǎn)移700μl SPW Wash buffer（已用無水乙醇稀釋的）至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。（濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標(biāo)簽的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下）。
   8） 重復(fù)用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。
   9） 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質(zhì)殘余的液體。
   10） 把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上，加入15~30μl（具體取決于預(yù)期的終產(chǎn)物濃度）的Elution Buffer（或TE緩沖液）到柱基質(zhì)上，室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA。*次洗脫可以洗出70-80%的結(jié)合DNA。如果再洗脫一次的話，可以把殘余的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會(huì)較低。

2. 連接反應(yīng)（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例）

   1） 在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 μl。
   pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
   Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
   dH₂Oup to 5 μl
   2） 加入5 μl（等量）的 Solution I。
   3） 16℃反應(yīng)30分鐘。（2 kbp以上長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA克隆時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間請(qǐng)延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)）。
   4） 全量（10 μl）加入至100 μl 感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。
   5） 42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
   6） 加入890 μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。
   7） 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落。
   8） 挑選白色菌落，鑒定載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。

注意事項(xiàng)

1. 使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer。不要重復(fù)使用，其PH的升高會(huì)減少產(chǎn)量。
2. 不論采取何種方法回收DNA，在回收過程中，要盡量減少洗脫體積，以便提高收得率和濃度，以方便后續(xù)操作。
3. 從膠上回收DNA時(shí)，應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈（300-360nm），以減少紫外光對(duì)DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。
4. 連接反應(yīng)時(shí)間是與溫度密切相關(guān)，因?yàn)榉磻?yīng)速度隨溫度的提高而加快。通?？刹捎?6℃連接4小時(shí)為宜，如是平端連接需要適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間以提高連接效率；在選擇反應(yīng)的溫度與時(shí)間關(guān)系時(shí)，也要考慮在反應(yīng)系統(tǒng)中其他因素的影響。
5. 連接反應(yīng)的整個(gè)過程應(yīng)注意槍頭的潔凈以避免造成對(duì)酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時(shí)應(yīng)在冰上操作且動(dòng)作迅速。
6. 連接反應(yīng)應(yīng)在25℃以下進(jìn)行，溫度升高較難形成環(huán)狀DNA，影響連接效率。長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物（2kb以上）進(jìn)行連接時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)。
7. 進(jìn)行克隆時(shí)，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比一般為1:2~10。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的摩爾數(shù)比。
8. 用的感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化效率≥1×10⁸ cfu/μg pUC19），這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。