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豬偽狂犬病毒gE 蛋白抗體檢測(cè)試劑盒

                    （中文說(shuō)明書僅為參考，以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)）

簡(jiǎn)介

    偽狂犬病毒 （PRV ）又稱Aujeszky’s 病毒，它屬于α-皰疹病毒，可導(dǎo)致豬群廣泛感染，在養(yǎng)豬業(yè)具有重要經(jīng)濟(jì)意義。它能引起廣泛的臨床癥狀包括神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、呼吸性疾病、繁 殖障礙和死亡。許多國(guó)家已經(jīng)開始了*偽狂犬病的計(jì)劃。PrioCHECK?PRV-gE 2.0 檢測(cè)豬 血清中的PRV gE 蛋白抗體，不受PRV gE 缺失疫苗免疫豬的抗體滴度影響。gE 蛋白抗體陽(yáng)性表明已用含gE 抗原的疫苗免疫和/或感染不同型的PRV 野毒。 PrioCHECKPRV-gE2.0能夠區(qū)分用gE基因缺失苗免疫的感染豬和免疫豬群。 PrioCHECKPRV-gE 2.0 可用于豬的血清流行病學(xué)研究，用來(lái)檢測(cè)測(cè)免疫豬群和感染豬群。

PrioCHECKPRV-gE 2.0 ELISA 和gE 缺失苗的使用是偽狂犬免疫-*聯(lián)合計(jì)劃的基礎(chǔ)。除

此之外，本試劑盒還可從未免疫豬群中檢測(cè)出感染豬。

檢測(cè)原理

    本試劑盒的原理是阻斷ELISA，用于檢測(cè)偽狂犬病毒gE蛋白抗體。PRV gE蛋白和特異 單抗（mAb）間的反應(yīng)被待測(cè)樣品中存在的特異性抗體阻斷。

用非感染性的PRV抗原包被酶標(biāo)板。每孔加入等體積未稀釋的豬血清和ELISA緩沖液

 （血清zui終稀釋度為1：2）酶標(biāo)板在37±1℃孵育1 h或5±3℃放置過(guò)夜。洗板后加入酶標(biāo) 單抗，37±1℃再次孵板1h。再次洗滌后加入顯色劑/底物溶液。20min后加入終止液終止顯色反應(yīng)并測(cè)定OD450nm 。

    試劑盒還有1份直接使用的弱陽(yáng)性質(zhì)控樣品，它的用途是：

    -  使客戶能分析PrioCHECK?PRV-gE 2.0 ELISA試劑盒的變化趨勢(shì)

- 使客戶能利用軟件和OD650值相應(yīng)地調(diào)整底物顯色時(shí)間

試劑盒組成

-  成分1  酶標(biāo)板5塊

-  成分2  濃縮的酶標(biāo)結(jié)合物 （30X）1瓶2.5ml稀釋后的酶結(jié)合物不穩(wěn)定，需現(xiàn)用現(xiàn)配。

-  成分3  濃縮稀釋緩沖液（2X）1瓶 60ml配制好的溶液可以在22±3℃保存4小時(shí)

-  成分4  濃縮洗液（200X）1瓶 60ml，配制好的溶液可以在22±3℃保存1周

-  成分5陰性對(duì)照（直接使用）1瓶1.5ml（綠色）

-  成分6陽(yáng)性對(duì)照（直接使用）1瓶1.5ml（紅色）

-  成分7弱陽(yáng)性對(duì)照 （直接使用）1瓶1.5ml（橙色）

-  成分8底物/顯色劑溶液（直接使用）1瓶 60ml

-  成分9終止液（直接使用）1瓶 60ml

-  其它成分：

10個(gè)封板膜、分析報(bào)告（Certificateof Analysis）、說(shuō)明書（Package Insert）

試劑盒未提供的其它材料：

常規(guī)化設(shè)施：

符合本國(guó)生物安全要求的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施

結(jié)果分析用設(shè)備：

酶標(biāo)儀，如Multiscan EX 或同類產(chǎn)品，需裝配450nm 濾光片

可選設(shè)備：

洗板機(jī)，如Tacan EIV Tray Washer 或同類產(chǎn)品。

注意事項(xiàng)

應(yīng)嚴(yán)格遵從本國(guó)的動(dòng)物樣本處理規(guī)定。PrioCHECK® PRV-gE 2.0 試劑盒應(yīng)在有條件的實(shí)驗(yàn)室

應(yīng)用。

應(yīng)該把樣品視為有潛在感染的物質(zhì)，所有與樣品接觸的材料應(yīng)該認(rèn)為有潛在的污染性。

化學(xué)試劑的安全性說(shuō)明見“Safety Regulations and R&S Statements”（Appendix II）

注意

?   為了獲得更佳的結(jié)果，需遵從下列因素：

?   嚴(yán)格遵守檢測(cè)程序

?   所有試劑在使用前放置室溫平衡。

?   每次吸液更換移液頭

?   每種試劑分開保存。

?   禁止使用過(guò)期試劑或性狀改變明顯的試劑

?   不要混用不同批次試劑盒中的試劑

?   試驗(yàn)需使用去離子水或相同質(zhì)量的水

需預(yù)先配制的溶液

    試劑盒中的所有試劑使用前恢復(fù)至室溫（22 ±3℃）。

1．ELISA 緩沖液：用去離子水或蒸餾水將濃縮稀釋緩沖液 （成份3）稀釋2 倍。濃縮稀釋緩沖液提供量可以配制120ml 。配制好的溶液可以在22 ±3℃保存4 小時(shí)

2．酶標(biāo)結(jié)合物：用ELISA  緩沖液新鮮配制酶標(biāo)結(jié)合物工作液。1 塊酶標(biāo)板需要配制12ml（0.4 ml 酶標(biāo)結(jié)合物濃縮液（30x）加入到11.6ml ELISA 緩沖液中）。

注意：酶標(biāo)結(jié)合物液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配）

3．洗液：用去離子水或蒸餾水將濃縮洗液稀釋200 倍。濃縮洗液的量足夠配制終體積為12L 的洗液。

   注意：可用商業(yè)化ELISA 洗板機(jī)洗滌。如無(wú)洗板機(jī)，每孔應(yīng)至少加入200uL洗液。隨后傾去酶標(biāo)板中的液體，按上述方法重復(fù)的次數(shù)。不必浸泡酶標(biāo)板。zui后一次沖洗后，用力拍干。

待測(cè)樣品

    血清樣品試驗(yàn)前可在4℃儲(chǔ)存幾天，也可在-20℃儲(chǔ)存更長(zhǎng)的時(shí)間。

檢測(cè)步驟

    所有試劑和樣品必須恢復(fù)至室溫（22 ±3℃），使用前輕輕倒置混合。

1．孵育待檢血清

1.1  每孔加入50ul ELISA 緩沖液。

1.2 向A1 和B1 孔中各加入50ul 陽(yáng)性對(duì)照。（成分7）

1.3 向C1 和D1 孔中各加入50ul 陰性對(duì)照（成分5）。

1.4 向E1 和F1 孔中各加入50ul 弱陽(yáng)性對(duì)照（成分6），此為可選步驟。

1.5  剩余每孔加入50ul 待測(cè)樣品 （單孔或復(fù)孔）。

1.6  用封板膜封板

1.7  輕輕振蕩酶標(biāo)板。

1.8 37±1℃孵育60min±10 min  （相對(duì)濕度大于90%）或5±3℃放置過(guò)夜。

2．孵育酶標(biāo)結(jié)合物

2.1 孵育結(jié)束后傾去酶標(biāo)板中的液體，用洗液洗板6 次。zui后一次洗滌后用力拍干。

2.2 每孔加入100ul 酶標(biāo)結(jié)合物工作液。

2.3 封板并輕輕振蕩酶標(biāo)板。

2.4 37±1℃孵育60min±20 min    （相對(duì)濕度大于90%）。

3．孵育顯色劑/底物溶液

3.1 孵育結(jié)束后傾去酶標(biāo)板中的液體，用200 至300ul 洗液洗板6 次。zui后一次洗滌后用力拍干。

3.2  每孔加入100ul 顯色劑/底物溶液。

3.3 在22 ±3℃（孵育20min     （15-30 min）。

3.4 加入100ul 終止液。

3.5 混合酶標(biāo)板孔中的內(nèi)容物。

注意：從*孔加入顯色劑/底物溶液開始，計(jì)時(shí)20min  后開始加終止液，加終止液的順序和速度一定要和加底物相同。

4．讀板并計(jì)算結(jié)果

4.1 終止顯色反應(yīng)后15min 內(nèi)測(cè)出OD450nm 。

4.2 計(jì)算陰性對(duì)照的平均值（C1 和D1 孔），此為zui大OD450 zui大值）。

4.3 陽(yáng)性對(duì)照、弱陽(yáng)性對(duì)照和待檢血清的阻斷率按下式計(jì)算：

注意：

                              待檢血清的OD450

PI =       100 － ----------------------------------------------- ×100

                              OD450 zui大值

5．有效性標(biāo)準(zhǔn)

基于OD450 的有效性確認(rèn)：

5.1 陰性對(duì)照（C1 和D1 孔）的平均值（zui大OD450 值）必須在0.9 以上。

5.2 陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率必須≥65%。

5.3 弱陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率必須≥45％。

5.4 不符合上述標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)舍棄。

基于OD650 的有效性確認(rèn)

5.5 陰性對(duì)照（C1 和D1 孔）的平均值（zui大OD650 值）必須在0.4 以上。

5.6 弱陽(yáng)性對(duì)照（E1 和F1 孔）OD650 值的必須>0.15。

5.7 弱陽(yáng)性對(duì)照除以陰性對(duì)照的平均OD650 值的阻斷率必須<0.6且>0.3。

5.8 不符合上述標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)舍棄

注意：如果zui大OD450 平均值低于1.000，可能是因?yàn)轱@色劑/底物溶液的溫度太低，此時(shí)應(yīng)預(yù)熱顯色劑/底物溶液至22 ±3℃或延長(zhǎng)孵育時(shí)間（zui多30min）。如果zui大OD450 平均值高于2.000 推薦縮短孵育時(shí)間。

如果樣品值大于zui大OD450 平均值，抑制率可以被認(rèn)為是0%。

6．結(jié)果判定

   PI＝＜35％              陰性               待測(cè)血清中不存在PRV-gE 特異性抗體

   PI＝≥35％              陽(yáng)性               待測(cè)血清中存在PRV-gE 特異性抗體。