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*的操作方法
點(diǎn)擊次數(shù)：1230 發(fā)布時(shí)間：2012-11-23
全套操作約需1小時(shí)，分勻漿、細(xì)胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟，詳細(xì)說(shuō)明如下。
一.勻漿和細(xì)胞裂解。
使用不同的實(shí)驗(yàn)材料需采用不同的勻漿步驟，具體說(shuō)明如下：
【從動(dòng)物組織中提取基因組DNA】
使用研缽進(jìn)行勻漿時(shí)：
?、偃?～100mg的動(dòng)物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。
注）下列組織請(qǐng)加液氮研磨至粉末狀。
A．富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。
B．富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。
C．富含角質(zhì)蛋白的組織或堅(jiān)硬的組織（如骨骼）等。
?、诩尤?50μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1，溫和研磨30秒鐘。
注）使用上述①-注）的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，請(qǐng)?jiān)诩尤隨olutionA及RNaseA1后，將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。
?、凼占?50μl研磨好的組織勻漿液移至CollectionTube中。如果勻漿體積不足650μl，請(qǐng)補(bǔ)充SolutionA至650μl，65℃保溫5分鐘。
二.使用研磨棒進(jìn)行勻漿時(shí)：
①取1～100mg的動(dòng)物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的CollectionTube中，用研磨棒快速研磨成糊狀。
?、诩尤?50μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1后用研磨棒快速研磨成勻漿。
?、奂尤?50μl的SolutionA將研磨棒上的勻漿沖入CollectionTube中，充分振蕩混合后，65℃保溫5分鐘。
【從植物材料或植物培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA】
?、侔聪卤矸Q取適量的新鮮植物材料（如選用的是冷凍干燥植物材料，則用量減半），剪成小塊放入研缽中，加入液氮，待樣品冷凍*后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時(shí)應(yīng)間斷加入液氮以防止材料融化。
植物材料種類
植物材料使用量*
植物花、葉片
10～100mg
植物莖
60～240mg
植物根
80～240mg
植物種子
80～240mg
*如選取植物的根、種子等樣品時(shí)，因其基因組DNA含量很低，需使用超過(guò)表格中所示的參數(shù)用量，此時(shí)請(qǐng)分兩管進(jìn)行步驟1～6的實(shí)驗(yàn)操作，在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一SpinColumn中過(guò)濾，使各管的基因組DNA結(jié)合到同一個(gè)SpinColumn上。
如從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取基因組DNA，請(qǐng)離心收集2×103～1×107的培養(yǎng)植物細(xì)胞，加入150μl水充分懸浮細(xì)胞后移入研缽中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。
注）樣品研磨應(yīng)充分，否則將會(huì)嚴(yán)重影響基因組DNA的收率。
②將研缽移至65℃水浴，當(dāng)樣品粉末剛開(kāi)始融化時(shí)，向研缽中加入700μl的SolutionA和1.2μl的RNaseA1，用力碾磨30秒。
?、凼占?50μl研磨好的組織勻漿移至CollectionTube中。如勻漿體積不足650μl，請(qǐng)補(bǔ)充SolutionA至650μl。65℃保溫15分鐘。
注）處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質(zhì)的種子等時(shí)，可延長(zhǎng)水浴時(shí)間至60分鐘。
【從全血中提取基因組DNA】
①取10～250μl的全血（含抗凝劑）加入至CollectionTube中。
②加入500μl的SolutionA。
③加入1μl的RNaseA1，激烈振蕩15秒鐘后，冰浴5分鐘。
注）人與動(dòng)物的抗凝全血的一次處理量為≤250μl；禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10μl。【從培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNA】
三.使用懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞時(shí)：
?、偈褂肅ollectionTube收集1×105～1.5×107的細(xì)胞懸浮液，5,000rpm離心5分鐘，棄上清（細(xì)胞培養(yǎng)液）。
?、诩尤?50μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細(xì)胞。
?、奂尤?00μl的SolutionA和0.8μl的RNaseA1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
四.使用貼壁細(xì)胞時(shí)：
?、贄壉M培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入650μl的SolutionA，室溫靜置1分鐘。
注）96孔板等的每個(gè)孔中一次容納不了650μl溶液時(shí)，請(qǐng)分?jǐn)?shù)次處理細(xì)胞。
?、谟靡埔簶尩臉岊^吹落貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，取650μl的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至CollectionTube中。
?、奂尤?.8μl的RNaseA1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
2.加入400μl的SolutionB，振蕩混合。
3.加入1ml的4℃預(yù)冷的SolutionC，充分混勻后，12,000rpm離心2分鐘。
4.棄去上層有機(jī)相，再加入1ml的4℃預(yù)冷的SolutionC，充分混勻后，12,000rpm離心2分鐘。
5.棄去上層有機(jī)相，然后將水相溶液（無(wú)色下層）轉(zhuǎn)移至置于CollectionTube上的FilterCup中，12,000rpm離心1分鐘。
注）有機(jī)相（上層）帶有顏色，請(qǐng)務(wù)必除盡，否則會(huì)阻礙DNA結(jié)合到DNA制備膜上。相間沉淀不必考慮，在過(guò)濾時(shí)將被去除。
6.棄FilterCup，在濾液中加入400μl的DBBuffer，混合均勻。
7.將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。將上述操作6混合溶液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。
8.將500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。
9.將700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。
注）請(qǐng)沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。
10.重復(fù)操作步驟9。
11.將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的*處加入50～200μl的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1分鐘。
注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至65℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率。
12.12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA。
如果實(shí)驗(yàn)室備有適合于SpinColumn接口的負(fù)壓裝置，可從上述操作步驟6完成以后進(jìn)行以下操作。
7.將試劑盒中的SpinColumn插到負(fù)壓裝置的插口上，將上述操作步驟6的混合溶液轉(zhuǎn)移到SpinColumn中，開(kāi)啟調(diào)節(jié)負(fù)壓裝置，緩慢吸走SpinColumn中的溶液（流速控制在1滴/秒）。
8.將負(fù)壓調(diào)至zui大，向SpinColumn中加入500μl的RinseA，吸盡SpinColumn中溶液。
9.向SpinColumn中加入700μl的RinseB，吸盡SpinColumn中溶液。
注）請(qǐng)沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。
10.重復(fù)操作步驟9。然后從負(fù)壓裝置上取下SpinColumn，將其安置于試劑盒中的CollectionTube上，12,000rpm離心1分鐘。
11.將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的*處加入50～200μl的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1分鐘。
注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至65℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率。
12.12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA。
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