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大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、重組DNA的轉化、克隆篩選
點擊次數(shù)：474 發(fā)布時間：2012-10-15
大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、重組DNA的轉化、克隆篩選
1. 實驗目的和要求
通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。
2. 相關知識及原理
感受態(tài)細胞（Competent cells）：
受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞（competent cell） 。
轉化（transformation）：
是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。
進入細胞的DNA分子通過復制表達，才能實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。
轉化的方法：
化學的方法（熱擊法）：使用化學試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞；
電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。
克隆的篩選：
主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐*、*、*、四環(huán)素、*等；將經過轉化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉化體，即帶有異源DNA分子的受體細胞。否則，如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的質粒。雖然只有那些含有被轉化質粒的細菌才能在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對于連接混合物而言，此時并不能確定哪個克隆含有插入片段。
重組質?？寺〉蔫b定
鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有a- 互補、小規(guī)模制備質粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。zui常用的方法是小規(guī)模制備質粒DNA進行酶切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以結合a-互補現(xiàn)象來篩選。
a-互補現(xiàn)象：
因為許多載體都帶有一個LacZ基因的調控序列和頭146個氨基酸的編碼信息，編碼a-互補肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型a-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內互補（a-互補）。當這種載體轉入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所以稱這種現(xiàn)象為a-互補現(xiàn)象。
由互補產生的β-半乳糖苷酶（LacZ）能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－b －D－半乳糖苷（X-gal）而產生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外源DNA 片段時，會造成LacZ（a-）基因的失活，破壞a-互補作用，就不能產生具有活性的酶。所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重組質粒的菌落為藍色。
3．儀器、材料和試劑
無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心機，移液器，微型離心管等；
菌株：E.coli DH5α
質粒：pBluscript KS+DNA 片段的質粒以及 pBluscript KS 空質粒；
LB培養(yǎng)基；含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐*，濃度50-100μg／mL，X-gal 20-48μg/ml, IPTG 100 μg/ml。一般將抗生素、X-gal和IPTG配制成1000μl儲備液，用時按培養(yǎng)基的量再加入）；預冷CaCl2溶液（0.1mol／L）