一、聚合酶鏈反應(yīng)的歷史回顧

1、核酸體外擴(kuò)增zui早的設(shè)想

由Khorana及其同事于1971年提出：“經(jīng)過DNA變 性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重視該過程便可克隆tRNA基 因”。但由于當(dāng)時很難進(jìn)行測序和合成寡核苷酸引物，且當(dāng)時(1970年)Smith等發(fā)現(xiàn)了 DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設(shè)想被人 們遺忘。

2、聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明

1985年，美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等人才發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人們夢寐以求的體外無限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實。其原理類似于DNA的體內(nèi) 復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。開始是使用大腸桿菌 dna聚合酶Klenow片段來擴(kuò)增人基因組中的特異片段。由于該酶不耐熱，因此，每次 加熱變性DNA后都要重新補(bǔ)加Klenow酶。在操作多份標(biāo)本時，這一過程耗時，費力， 且易出錯。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR反應(yīng)更易于自動化，繼而PE-Cetus公司推 出了*臺PCR熱循環(huán)儀，使該技術(shù)的自動化成為現(xiàn)實。Mullis等因此項技術(shù)于1993年 獲得諾貝爾獎金。

二、聚合酶鏈反應(yīng)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展

PCR及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展速度是驚人的。上分別于1988年和1990年在美國和 英國召開了*屆和第二屆PCR技術(shù)專題研討會。*屆會議主要討論了PCR的應(yīng)用 與技術(shù)本身的優(yōu)化問題；第二屆會議的主要議題是人類基因組計劃與PCR的進(jìn) 展。這充分體現(xiàn)了生物學(xué)家對PCR的重視。

(表)聚合酶鏈反應(yīng)的相關(guān)技術(shù)

名 稱

主要用途

簡并引物擴(kuò)增法

擴(kuò)增未知基因片段
巢居PCR

提高PCR敏感性、特異性，分析突變
復(fù)合PCR

同時檢測多個突變或病原
反向PCR

擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變
單一特異引物PCR

擴(kuò)增未知基因組DNA
單側(cè)引物PCR

通過已知序列擴(kuò)增未知cDNA
錨定PCR

分析具備不同末端的序列
增效PCR

減少引物二聚體，提高PCR特異性
固著PCR

有利于產(chǎn)物的分離
膜結(jié)合PCR

去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留
表達(dá)盒PCR

產(chǎn)生合成或突變蛋白質(zhì)的DNA片段
連接介導(dǎo)PCR

DNA甲基化分析、突變和克隆等
RACE-PCR

擴(kuò)增cDNA末端
定量PCR

定量mRNA或染色體基因
原位PCR

研究表達(dá)基因的細(xì)胞比例等
臆斷PCR

鑒定細(xì)菌或遺傳作用
通用引物PCR

擴(kuò)增相關(guān)基因或檢測相關(guān)病原
信使擴(kuò)增表型分型(mapping)

同時分析少量細(xì)胞的mRNA
三、其它擴(kuò)增技術(shù)

與PCR及其相關(guān)技術(shù)發(fā)展的同時，新的擴(kuò)增技術(shù)也不斷誕生。這些技術(shù)各有利 弊，與PCR互為補(bǔ)充，有的可結(jié)合應(yīng)用，共同構(gòu)成了核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的大家族。我 們相信，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這一家族一定會再涌現(xiàn)出新成員。

其它體外核酸擴(kuò)增技術(shù)(表)

技術(shù)

應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)

檢測HIV

連接酶鏈反應(yīng)(LCR)

檢測點突變

自主序列復(fù)制(3SR)系統(tǒng)

研究RNA，臨床應(yīng)用、法醫(yī)學(xué)等

鏈替代擴(kuò)增(SDA)

檢測、鑒定基因

Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)

增加探針檢測敏感性

循環(huán)探針反應(yīng)

增加探針檢測敏感性